微囊藻素(Microcystin)檢測(cè)試劑

來源：Seebio.cn作者：西寶生物人氣：-發(fā)表時(shí)間：2012-02-09 13:54:00【大中小】

微囊藻素( Microcystins,MC)是由藍(lán)藻水華所產(chǎn)生的一種肝毒素。80%的藍(lán)藻水華都可以檢測(cè)出次生代謝產(chǎn)物—微囊藻素,它能夠強(qiáng)烈抑制蛋白磷酸酶的活性,當(dāng)細(xì)胞破裂或衰老時(shí)毒素釋放進(jìn)入水中,同時(shí)它還是強(qiáng)烈的肝胺腫瘤促進(jìn)劑。中國(guó)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)( GB 5749-2006)的頒布,將飲用水中微囊藻素含量限制為1ug/L,該標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施對(duì)水源水的質(zhì)量提出了更高的要求。

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編號(hào)	英文名稱	中文名稱	包裝
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ALX-350-012-C100	Microcystin-LR	LR 微囊藻素	100μg
ALX-350-012-C500	Microcystin-LR	LR 微囊藻素	500μg
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ALX-350-043-C050	Microcystin-RR	RR 微囊藻素	50μg
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ALX-350-043-C250	Microcystin-RR	RR 微囊藻素	250μg
ALX-350-043-C500	Microcystin-RR	RR 微囊藻素	500μg
ALX-350-043-M001	Microcystin-RR	RR 微囊藻素	1mg
ALX-350-096-C100	Microcystin-LA	LA 微囊藻素	100μg
ALX-350-081-C025	Microcystin-LF	LF 微囊藻素	25μg
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ALX-804-320-C200	Monoclonal Antibody to Microcystin-LR(MC10E7)	LR 微囊藻素單克隆抗體測(cè)試劑	200μg
ALX-850-319-K101	Microcystins (Adda specific) ELISA Kit	微囊藻素試劑盒	1Kit
ALX-804-585-C100	Monoclonal Antibody to Microcystins (Adda specific) (AD4G2)	微囊藻素單克隆抗體測(cè)試劑	100μg

微囊藻素介紹

一、概述

隨著社會(huì)工業(yè)化進(jìn)程的加快，人類在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及日常生活中，向水體排入大量含氮、磷的污染物，加速了湖泊的富營(yíng)養(yǎng)化(Eutrophication)，藻類(Algae)由此而獲取豐富的營(yíng)養(yǎng)而大量繁殖。最近的調(diào)查表明，亞太地區(qū)54%的湖泊富營(yíng)養(yǎng)化，歐洲、非洲、北美洲和南美洲的比例分別是53%，28%，48%和41%，我國(guó)則是60%。

在富營(yíng)養(yǎng)化的淡水水體中，當(dāng)有適宜的化學(xué)物理?xiàng)l件時(shí)，水體中的藻類短時(shí)間內(nèi)大量繁殖并聚集的生態(tài)異常現(xiàn)象稱為水華（Water Blooms, 也稱湖靛）；這一現(xiàn)象若發(fā)生在海洋里則通常稱為赤潮（Red Tide）。淡水水體富營(yíng)養(yǎng)化危害最大的一個(gè)表征是水華的出現(xiàn)，每年夏、秋季節(jié)，在一些淡水湖泊均會(huì)形成大量水華，致使水質(zhì)日趨惡化。

當(dāng)水華出現(xiàn)時(shí)，水面被厚厚的藍(lán)綠色湖靛所覆蓋，甚至在岸邊大量堆積。在藻體大量死亡分解的過程中，不但散發(fā)惡臭，破壞景觀；同時(shí)大量消耗水中溶解氧，使魚類窒息死亡；尤其是藻類能釋放生物毒素——藻毒素(Algae Toxins)，這些類次級(jí)代謝產(chǎn)物嚴(yán)重危害人類和其他生物的安全。隨著富營(yíng)養(yǎng)化的加劇，藻類水華發(fā)生的頻率和幅度也增加，有毒水華對(duì)水環(huán)境的危害和生物安全更日益引起廣泛的關(guān)注。

淡水中藍(lán)綠藻屬(Cyanobacteria，Blue-green Algae)分泌產(chǎn)生的藍(lán)藻毒素是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的污染范圍最廣，研究最多的一類藻毒素。其中的微囊藻素LR (Microcystin-LR)是目前已知的毒性最強(qiáng)的、急性危害最大的一種淡水藍(lán)藻毒素。

由于未及時(shí)地檢測(cè)水質(zhì)情況的污染變化及采取相應(yīng)的控制措施，致使這些毒素富集于魚類或貝類中并通過食物鏈傳遞，直接存在于飲用水或娛樂用水中，嚴(yán)重威脅人類的健康，全球已經(jīng)發(fā)生了多起有關(guān)藻毒素中毒并引起死亡的事故。近年來淡水藻類污染已成為一個(gè)全球性的環(huán)境問題。

目前，為了保障人民的身體健康，我國(guó)現(xiàn)頒布執(zhí)行的生活飲用水水質(zhì)衛(wèi)生規(guī)范（2001，0.001mg/L）和地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（GB3838-2002。微囊藻素-LR，0.001mg/L）都包含了微囊藻素的檢測(cè)項(xiàng)目；世界衛(wèi)生組織(WHO)在其推薦的飲用水標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)（第二版）中也增加了微囊藻素（MC-LR, 1ug/L）等指標(biāo)（WHO. 1998），其中都有關(guān)于微囊藻素LR的檢測(cè)。

目前對(duì)水體中藻毒素的檢測(cè)技術(shù)研究還比較落后。大多數(shù)藻毒素使用價(jià)格昂貴、體積龐大的HPLC-MS或GC-MS檢測(cè)，樣品制備過程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，需要專業(yè)技術(shù)人員操作，檢測(cè)費(fèi)用很高。因此限制了常規(guī)監(jiān)測(cè)次數(shù)。近年來，美國(guó)、德國(guó)和日本等國(guó)家的科學(xué)家運(yùn)用免疫技術(shù)結(jié)合計(jì)算機(jī)、傳感器技術(shù)，研究水中藻毒素（尤其是微囊藻素-LR）的原位免疫檢測(cè)方法。通過對(duì)居民生活飲用水水質(zhì)的監(jiān)測(cè)，為居民的身體健康提供保障，為控制和去除水體中的藻毒素提供幫助。

二、微囊藻素的分子結(jié)構(gòu)

微囊藻素是一組環(huán)狀七肽，一般結(jié)構(gòu)為：
環(huán)(-D-Ala-L-X-D-Masp-L-Z-Adda-D-Glu-Mdha)

其中：L為左旋；D為右旋。
Masp(有時(shí)寫作MeAsp)為Ｄ-赤-β-甲基天冬氨酸；
Adda為(2s,3s,8s,9s)-3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基-4,6-二烯酸；
Mdha為Ｎ-甲基脫氫丙氨酸。
X和Z為兩種可變的L-氨基酸，目前已發(fā)現(xiàn)下列三種XZ組合的藻毒素毒性較大：LR、RR和YR，其中L、R、Y分別代表Leu(亮氨酸)、Arg(精氨酸)和Tyr(酪氨酸)。2、4位氨基酸也是微囊藻素命名的依據(jù)。

構(gòu)成環(huán)狀七肽的七個(gè)氨基酸，其中5個(gè)是非蛋白質(zhì)氨基酸，2個(gè)(2、4點(diǎn)位)是蛋白質(zhì)氨基酸。由于XZ的不同及Masp和Adda的甲基化或去甲基化產(chǎn)生的差異，可以形成多種不同的微囊藻素異構(gòu)體。目前已從不同微囊藻菌株中分離、鑒定了60多種微囊藻素結(jié)構(gòu)。目前已知存在的最普遍、含量相對(duì)較多，毒性較大的是主要是MC-LR，MC-RR，MC-YR等數(shù)種，這幾種也是可商品購買的。

三、物理和生化性質(zhì)

藻毒素具有水溶性和耐熱性。易溶于水，甲醇或丙酮，不揮發(fā)，抗pH變化。MC-LR的分子式為C₄₉H₇₄N₁₀O₁₂，分子量為995.2（計(jì)算時(shí)往往按1000計(jì)）。

其在水中的溶解性大于1ｇ/Ｌ，化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定。在水中藻毒素自然降解過程是十分緩慢的，當(dāng)水中的含量為5ug/Ｌ時(shí)，三天后，僅10%被水體中微粒吸收，7%隨沙沉淀。藻毒素有很高的耐熱性，加熱煮沸都不能將毒素破壞，也不能將其去除；自來水處理工藝的混凝沉淀、過濾、加氯也不能將其去除。有調(diào)查試驗(yàn)研究表明在某湖周圍3個(gè)自來水廠的出廠水中檢出低濃度的藻毒素(128～1400ng/L)，結(jié)果提示采用常規(guī)的飲水消毒處理不能完全消除水體中的藻毒素。

它是一種肝毒素，這種毒素是肝癌的強(qiáng)烈促癌劑。家畜及野生動(dòng)物飲用了含藻毒素的水后，會(huì)出現(xiàn)腹瀉、乏力、厭食、嘔吐、嗜睡、口眼分泌物增多等癥狀，甚至死亡。病理病變有肝臟腫大、充血或壞死，腸炎出血、肺水腫等。

對(duì)于人類健康，微囊藻素也具有很大危害性。其中MC-LR的半致死劑量（LD50）約為50~100 ug/kg。人們?cè)谙丛琛⒂斡炯捌渌闲蓍e和運(yùn)動(dòng)時(shí)，皮膚接觸含藻毒素水體可引起敏感部位(如眼睛)和皮膚過敏；少量喝入可引起急性腸胃炎；長(zhǎng)期飲用則可能引發(fā)肝癌。醫(yī)學(xué)部門已發(fā)現(xiàn)飲水中微量微囊藻素與人群中原發(fā)性肝癌的發(fā)病率有很大相關(guān)性。1996年在巴西造成100多名急性肝功能故障，7個(gè)月內(nèi)至少50人死于藻毒素產(chǎn)生的急性效應(yīng)，引起舉世矚目的關(guān)注。淡水水體中的藍(lán)藻毒素已成為全球性的環(huán)境問題，世界各地經(jīng)常發(fā)生藍(lán)藻毒素中毒事件。

四、微囊藻素的危險(xiǎn)評(píng)價(jià)及控制標(biāo)準(zhǔn)

既然水體中的藍(lán)藻毒素對(duì)人類具有潛在的危害，就有必要對(duì)水體中的藍(lán)藻毒素進(jìn)行危險(xiǎn)評(píng)價(jià)。

目前尚沒有強(qiáng)制性的飲水中藻毒素含量衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，各國(guó)已有飲水中的藻毒素含量標(biāo)準(zhǔn)一般都為微囊藻素-LR的含量。世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的飲水中的藻毒素標(biāo)準(zhǔn)為1.0ug/Ｌ，加拿大健康組織規(guī)定飲水中可接受的藻毒素標(biāo)準(zhǔn)為0.5ug/Ｌ（Guidelines for Canadian Drinking Water Quality, 1993），澳大利亞學(xué)者建議1μｇ/Ｌ的含量為安全飲用水的上限。我國(guó)尚未制定飲水中微囊藻素含量標(biāo)準(zhǔn)，在即將頒布的生活飲用水衛(wèi)生規(guī)范中已將微囊藻素-LR的標(biāo)準(zhǔn)值列入，參照WHO標(biāo)準(zhǔn)，定為0.001ｍｇ/Ｌ。

根據(jù)表1的數(shù)據(jù)，我們可以推測(cè)，那些飲用未經(jīng)處理的地表水的人群有攝入藍(lán)藻毒素的危險(xiǎn)，特別是在藍(lán)藻水華發(fā)生的高峰季節(jié)。由此，可以看出藍(lán)藻毒素對(duì)發(fā)展中國(guó)家，特別是農(nóng)村地區(qū)的人群比發(fā)達(dá)國(guó)家的人群具有更高的危險(xiǎn)。但是，飲用經(jīng)處理的地表水的人群并非就沒有攝入藍(lán)藻毒素的危險(xiǎn)了，因?yàn)槟壳皞鹘y(tǒng)的水處理方法在去除藍(lán)藻毒素方面效果并不好。無論對(duì)哪一類人群，兒童和嬰兒均比成人具有更高的攝入藍(lán)藻毒素的危險(xiǎn)。

表1　飲用水中藍(lán)藻毒素的最高允許含量　μg·L-1

藍(lán)藻毒素	嬰兒1)	兒童	成人
微囊藻素	0.20	0.29	0.88
微囊藻素-LR 2)	0.07	0.11	0.32

1)嬰兒、兒童和成人的體重分別按5、10、60kg計(jì)，每日飲水量分別按0.75、1、2Ｌ計(jì)；
2)由口服給藥所得結(jié)果；

五、微囊藻素的檢測(cè)方法

現(xiàn)在對(duì)水體中微囊藻素的檢測(cè)已發(fā)展了多種分析方法，主要有生物分析法、化學(xué)分析法和生化分析法。

5.1 生物分析法

傳統(tǒng)的生物分析法通常用小鼠腹腔注射或口腔灌喂評(píng)價(jià)微囊藻素的毒性。

用純化的微囊藻素或水華藍(lán)藻中粗提藻毒素進(jìn)行測(cè)試，根據(jù)其生理病變及半致死量可初步確定其毒性(除個(gè)別異構(gòu)體的LD₅₀為200～250μg/kg，多數(shù)微囊藻素的LD₅₀為60～70ug/kg)。這也是毒理評(píng)價(jià)的常用方法。此外還有用無脊椎動(dòng)物如蝦、貝、水蚤及其卵進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)的研究，以細(xì)菌進(jìn)行生物分析也有報(bào)道。這類方法靈敏度較差，所得到的毒型結(jié)果與小鼠的品系有關(guān)，可比性較差，且無法確定毒素類型及結(jié)構(gòu)。但該方法操作簡(jiǎn)單，且可以監(jiān)測(cè)到過去未曾發(fā)現(xiàn)的新毒素。

5.2 化學(xué)分析法

化學(xué)分析法主要包括氣相色譜 (GC)、薄層色譜(TLC)、高效液相色譜(HPLC)、液相色譜/質(zhì)譜分析(LC/MS)及毛細(xì)管電泳(CE)等，其中HPLC應(yīng)用最廣。這些方法利用微囊藻素的物化性質(zhì)結(jié)合靈敏的光電技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定性、定量分析。

（一）、高效液相色譜(HPLC)

液相色譜可以分析一些氣相色譜無法分析的揮發(fā)性差、極性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。常用的檢測(cè)器有紫外-可見光（UV-VIS）(ultraviolet- visible)檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、熒光、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器、火焰離子化檢測(cè)器和電化學(xué)檢測(cè)器等。

HPLC>技術(shù)一般采用正相或反相色譜柱對(duì)毒素進(jìn)行分離，然后進(jìn)行紫外、熒光或化學(xué)發(fā)光(CL)檢測(cè)。將被測(cè)毒素與標(biāo)準(zhǔn)毒素的滯留時(shí)間進(jìn)行比較可對(duì)被測(cè)毒素進(jìn)行鑒定，將被測(cè)毒素與標(biāo)準(zhǔn)毒素的峰面積進(jìn)行比較可對(duì)其進(jìn)行精確定量。目前常采用HPLMC進(jìn)行監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)限度一般為ng級(jí)。

高效液相色譜是目前應(yīng)用、研究較多的方法，這一方面取決于微囊藻素本身的物理和化學(xué)性質(zhì)，另一方面也因?yàn)樵摲ㄓ辛己玫撵`敏度(可達(dá)0.1μｇ/Ｌ)和選擇性。其步驟是先將水華藍(lán)藻的毒素提取液或?qū)嶋H水樣通過固相萃取吸附富集，溶劑淋洗后將凈化的微囊藻素洗脫，用于定性分析。用于色譜分析。同時(shí)，可利用液相色譜的特點(diǎn)，與質(zhì)譜或核磁共振聯(lián)用確定其分子式和結(jié)構(gòu)。

（二）、LC/MS

HPLC監(jiān)測(cè)技術(shù)往往需要標(biāo)準(zhǔn)毒素，而目前已發(fā)現(xiàn)60多種MC，多數(shù)缺乏標(biāo)準(zhǔn)毒素，這限制了HPLC的進(jìn)一步應(yīng)用。LC/MS技術(shù)很好地解決了這一問題，即使沒有標(biāo)準(zhǔn)毒素，只要知道這種毒素的分子量，就可對(duì)其進(jìn)行定性，而且LC/MS技術(shù)亦可對(duì)毒素進(jìn)行精確定量。快速原子轟擊質(zhì)譜(FABMS)和液相次級(jí)離子質(zhì)譜(LSIMS)是確定毒素分子量的有效手段。

（三）、氣相色譜法(GC)

氣相色譜法的一次進(jìn)樣可以對(duì)多種物質(zhì)混合樣品的各個(gè)組分進(jìn)行定性、定量分析。氣相色譜法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、分離效能高、選擇性強(qiáng)、分析速度快。局限性主要表現(xiàn)在如果沒有標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)照，就無法定性分離組分。用于氣相色譜法的檢測(cè)器多達(dá)十幾種，如電子捕捉檢測(cè)器、氫火焰離子化檢測(cè)器、堿離子化檢測(cè)器等。其中電子捕捉檢測(cè)器只對(duì)具有電負(fù)性的物質(zhì)（鹵素、硝基、氧原子等化合物）有響應(yīng)，而且選擇性強(qiáng)、靈敏度高，廣泛應(yīng)用于有機(jī)氯農(nóng)藥和其它含有電負(fù)性原子的農(nóng)藥殘留檢測(cè)。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用GC-MS）技術(shù)已經(jīng)比較成熟，結(jié)合了氣相色譜分離特性強(qiáng)和質(zhì)譜儀良好的定性能力，使分離、定量和定性同時(shí)進(jìn)行。但是它的局限性在于只適合于分析可以氣化的樣品。目前高分辨氣相色HRGC-HRMS）（High Respective）技術(shù)可以檢測(cè)到單位體積內(nèi)幾個(gè)fg的量。如此高的檢測(cè)靈敏度也會(huì)帶來一些問題，因?yàn)闃悠房赡芎芸鞎?huì)被接觸到的玻璃容器、試劑甚至是實(shí)驗(yàn)室的空氣所污染。

GC和GC/MS可用于MC總量的測(cè)定。

最近又發(fā)展了毛細(xì)電泳(CE)法。后者分析速度快、具有柱上富集功能并應(yīng)用激光誘導(dǎo)熒光(laser-induced fluorescence, LIF)檢測(cè)器提高靈敏度。此外，同生化檢測(cè)法相比，CE易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，避免了放射性物質(zhì)。TLC也是有效的毒素監(jiān)測(cè)手段，易于操作，不需特殊設(shè)備，監(jiān)測(cè)限度可達(dá)ng級(jí)，但在監(jiān)測(cè)的靈敏度方面要遜色于HPLC。

5.3 細(xì)胞毒性檢測(cè)技術(shù)

細(xì)胞毒性檢測(cè)技術(shù)是利用毒素對(duì)細(xì)胞的毒性作用來監(jiān)測(cè)毒素的一種技術(shù)，不僅可以判斷毒素存在與否，而且可以對(duì)毒素進(jìn)行精確的定量。這種方法監(jiān)測(cè)的也是能發(fā)揮相同毒性作用的毒素的總量。

Fladmark等建立了一種根據(jù)MC導(dǎo)致鮭魚或大鼠肝細(xì)胞凋亡的程度來確定MC的方法。他們將分離的鮭魚或大鼠的肝細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，然后加入MC，根據(jù)細(xì)胞凋亡的程度即可求出MC的含量，監(jiān)測(cè)限度為10～20ng。

動(dòng)物細(xì)胞凋亡的第一個(gè)信號(hào)是發(fā)生凋亡的細(xì)胞與鄰近的細(xì)胞分離。根據(jù)這一特性，F(xiàn)ladmark等還建立了用MC導(dǎo)致懸浮培養(yǎng)的鮭魚或大鼠肝細(xì)胞解聚的程度來監(jiān)測(cè)毒素的方法，所得結(jié)果比用判斷細(xì)胞凋亡的程度所得結(jié)果靈敏5～10倍。

5.4 酶活性抑制檢測(cè)技術(shù)

由于MC等能夠抑制PP1和PP2A的活性，因此可以通過對(duì)酶活性的抑制程度來監(jiān)測(cè)這幾種毒素。自Holmes等提出蛋白磷酸酶抑制檢測(cè)(protein phosphatase inhibition assay, PPIA)技術(shù)以來，這種技術(shù)得到了迅速發(fā)展。PPIA多數(shù)以³²P標(biāo)記的糖原磷酸化酶a為底物。由于糖原磷酸化酶a只能被PP1和PP2A水解，而PP1和PP2A又可被MC等抑制，因此在MC、PP和糖原磷酸化酶反應(yīng)后根據(jù)PP水解糖原磷酸化酶a釋放出³²P的量就可計(jì)算出毒素的量。一般用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)毒素MC-LR作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用MC-LR的量來代表總毒素的量。隨著對(duì)硝基苯酚磷酸酯(pNPP)可被PP水解現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，人們建立了一種以pNPP為底物的磷酸酶抑制比色監(jiān)測(cè)技術(shù)，根據(jù)pNPP被水解后產(chǎn)生的有色產(chǎn)物的多少來確定毒素的量。PPIA的監(jiān)測(cè)限度為pg級(jí)，它監(jiān)測(cè)的是能抑制PP的總毒素的量，而不是某一種毒素的量。但藍(lán)藻本身具有的內(nèi)源蛋白磷酸酶活性有可能使PPIA的結(jié)果偏低。

5.5 免疫檢測(cè)

毒素的免疫監(jiān)測(cè)技術(shù)的原理是利用毒素誘發(fā)免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體，利用抗體對(duì)抗原的特異性識(shí)別來對(duì)各種毒素進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

最早的免疫檢測(cè)是免疫化學(xué)技術(shù)中最有效的一種分析方法，1960年由Yalow和Berson開創(chuàng)的，用于檢測(cè)血液中的胰島素。從此，免疫檢測(cè)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥化學(xué)分析領(lǐng)域，檢測(cè)激素、藥品、病毒等。免疫檢測(cè)操作非常簡(jiǎn)單，但是在環(huán)境污染物檢測(cè)分析中的實(shí)際應(yīng)用卻非常少。

免疫檢測(cè)的基礎(chǔ)是抗原抗體之間的反應(yīng)。它是以一種抗體或多種抗體作為分析試劑，對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量或定性分析的檢測(cè)方法。抗體是一種免疫球蛋白，它是動(dòng)物機(jī)體對(duì)外來物質(zhì)（抗原）發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生的。抗體可以和抗原物質(zhì)形成抗原-抗體復(fù)合物。在免疫化學(xué)分析方法中，未反應(yīng)的抗原和抗體被稱作自由相，抗原- 抗體復(fù)合物被稱作結(jié)合相。抗原和抗體之間的反應(yīng)具有特異性，并且非常靈敏。這些特性對(duì)于動(dòng)物機(jī)體防御疾病和免疫檢測(cè)都非常重要。隨著樣品檢測(cè)費(fèi)用的不斷提高和檢測(cè)項(xiàng)目的不斷增加，發(fā)展了免疫化學(xué)檢測(cè)方法；另一方面，對(duì)快速、簡(jiǎn)單的原位檢測(cè)的需求，也促進(jìn)了免疫檢測(cè)的發(fā)展。免疫檢測(cè)可以廣泛地用于檢測(cè)許多不同的化合物。

自80年代開始，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)開始用于MC的監(jiān)測(cè)。水質(zhì)免疫檢測(cè)中最常用的檢測(cè)方法是競(jìng)爭(zhēng)性非勻相酶聯(lián)免疫檢測(cè)。在這個(gè)檢測(cè)方法通常將抗體包被在96孔板（聚苯乙烯微量滴定板）的微孔底部，或者其他固定相上。把酶標(biāo)記在已知濃度半抗原上，以便產(chǎn)生可以檢測(cè)的信號(hào)。在待測(cè)半抗原和已知濃度的酶標(biāo)記和抗體形成復(fù)合物之后，將剩余的試劑洗脫，加入酶的底物，產(chǎn)生顯色反應(yīng)。根據(jù)顏色的深淺，定量抗原，或者根據(jù)是否顯色，判別樣品中是否有分析物存在。

Chu等人首先提出了應(yīng)用ELISA監(jiān)測(cè)MC的完整程序，他們將MC-LR與牛血清蛋白偶聯(lián)，用得到的偶聯(lián)物免疫兔制備兔抗MC-LR多克隆抗體(PAb)，然后將MC-LR與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，以鄰苯二胺(OPD)為底物用直接競(jìng)爭(zhēng)法做ELISA。用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)毒素MC-LR作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)底物的顯色程度與標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較即可求出毒素的含量，監(jiān)測(cè)限度為0.20μg/L。他們發(fā)現(xiàn)抗MC-LR PAb與MC-LR，-RR，-YR有較好的交叉反應(yīng)性，但與MC-LY，-LA的交叉反應(yīng)性低。An和Carmichael證實(shí)了Chu等的觀點(diǎn)，并提出C-6上為E-型的Adda和Arg對(duì)毒素的抗原性是必需的。McDermott等用從雞蛋黃中提取的抗MC-LR PAb做ELISA監(jiān)測(cè)毒素，發(fā)現(xiàn)監(jiān)測(cè)限度為95ng/L。這種方法制備的抗體產(chǎn)量大，方法簡(jiǎn)便，而且對(duì)MC-LR和-RR有良好的交叉反應(yīng)性。盡管抗MC的單克隆抗體(MAb)很早就已制備，但直到1995年才由Nagata等建立起一整套完整的ELISA監(jiān)測(cè)技術(shù)，其監(jiān)測(cè)限度為25ng/L。最近，他們又制備了能夠特異性的識(shí)別抗MC-MAb和MC形成的免疫復(fù)合體(immune complex)但不與MC或抗MC MAb反應(yīng)的單克隆抗體，并建立了一種三明治監(jiān)測(cè)技術(shù)，監(jiān)測(cè)限度為2ng/L。目前已有針對(duì)MC的ELISA試劑盒可以買到，這大大方便了毒素的監(jiān)測(cè)工作。但目前的試驗(yàn)表明抗體往往只是針對(duì)某一種毒素建立起來的，對(duì)某些毒素的交叉反應(yīng)性低，不能監(jiān)測(cè)所有的毒素。有研究表明，將分別針對(duì)某一種毒素做ELISA所得結(jié)果加起來后與用小鼠法所得結(jié)果有很好的一致性。

酶聯(lián)免疫法由于具有靈敏、快速、簡(jiǎn)單、便攜、易用、適用現(xiàn)場(chǎng)分析等特點(diǎn)，顯示出良好的發(fā)展趨勢(shì)。

常規(guī)的理化檢測(cè)儀器，特別是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）儀器體積龐大、價(jià)格昂貴、需要環(huán)境條件較高的室內(nèi)環(huán)境、而且還需要專門的技術(shù)人員操作，因此檢測(cè)費(fèi)用居高不下（＄40-200/樣品）；磷酸酶抑制試驗(yàn)和細(xì)胞試驗(yàn)雖然都能很好地檢測(cè)出毒素，但是靈敏度太低，甚至不能有效地檢測(cè)出WHO推薦的1mg/L；同時(shí)，環(huán)境監(jiān)測(cè)的項(xiàng)目、樣品數(shù)量不斷增多，檢測(cè)限不斷提高。免疫分析是基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的分析方法，檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析容量大、反應(yīng)速度快、檢測(cè)費(fèi)用低廉（＄5-10/樣品）。因此，免疫分析技術(shù)受到了各國(guó)的重視。美國(guó)、德國(guó)在80年代末開始研究免疫檢測(cè)方法，世界糧農(nóng)組織（FAO）已經(jīng)相許多國(guó)家推薦這項(xiàng)技術(shù)。因而開發(fā)和利用免疫檢測(cè)技術(shù)是有前景的，美國(guó)國(guó)家環(huán)保局（EPA）目前推行的幾種用于檢測(cè)環(huán)境中microcystins的方法按先后順序依次為：

• Immunoassay
• Bioassay
• Protein phosphatase assay
• HPLC
• LC/MS

由于微量藍(lán)藻毒素對(duì)人類危害嚴(yán)重，迫切需要對(duì)水體中特別是做為飲水水源的湖泊、河流和水庫中的藍(lán)藻毒素進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)。上面提到的監(jiān)測(cè)技術(shù)是針對(duì)分布廣、毒性大的微囊藻素建立的，這些監(jiān)測(cè)技術(shù)各有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，對(duì)比如表2所示。

表2　微囊藻素監(jiān)測(cè)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

監(jiān)測(cè)技術(shù)	優(yōu)點(diǎn)	缺點(diǎn)
小鼠法	毒素的有害效應(yīng)易檢測(cè)到	不能區(qū)分微囊藻素的異構(gòu)體
小鼠法	操作簡(jiǎn)單	工作量大；倫理問題
HPLC	對(duì)不同毒素可進(jìn)行定性和定量	毒素需預(yù)處理；靈敏度較低
HPLC	對(duì)不同毒素可進(jìn)行定性和定量	設(shè)備龐大、昂貴；需專業(yè)人員
ELISA	可檢測(cè)到毒素的不同同系物	對(duì)多種同系物的識(shí)別需要廣譜抗體；商品化的試劑盒可靠性需進(jìn)一步檢驗(yàn)；標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一
	商品試劑盒的出現(xiàn)大大方便了操作
	高靈敏度
PPIA(放射標(biāo)記或顯色)	只監(jiān)測(cè)PP1和PP2A的抑制劑	測(cè)定毒素總量，不能區(qū)分特異的毒素同系物
PPIA(放射標(biāo)記或顯色)	高靈敏度	需要新制備的放射性底物；放射性廢物的處理困難
細(xì)胞毒性監(jiān)測(cè)	用原代肝細(xì)胞可獲得高靈敏度	原代肝細(xì)胞的生產(chǎn)工作量大
細(xì)胞毒性監(jiān)測(cè)	用建立的細(xì)胞系可方便實(shí)驗(yàn)	建立的細(xì)胞系往往靈敏度較低