蛋白酶k是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，用于生物樣品中蛋白質(zhì)的一般降解。從林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中純化得到。蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵。此酶經(jīng)純化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩(wěn)定，還具有降解天然蛋白質(zhì)的能力。

應(yīng)用 

西寶生物專業(yè)提供蛋白酶K Proteinase K（CAS:39450-01-6)，客服熱線：400-021-8158。

品名	蛋白酶 K / Proteinase K
來源	林伯氏白色念球菌（Tritirachium album limber）
外觀	白色凍干粉
比活	>30U/mg蛋白
分子量	29,730
CAS No.	39450-01-6
EC No	3.4.21.14
活性單位定義	37℃、pH 7.5條件下，每分鐘可水解底物酪蛋白生成1μmol酪氨酸的蛋白酶K的量，定義為一個(gè)單位（U）。
DNase殘留	以λDNA為底物，37℃消化6小時(shí)以上，未檢測(cè)到脫氧核糖核酸酶活性。
RNase殘留	25℃消化16小時(shí)以上，未檢測(cè)到核糖核酸酶活性。
失活方法	反應(yīng)體系中加入PMSF或DFP抑制劑即可失活，65℃溫育10-15min可部分失活
包裝	100mg，1g，10g，1kg 大包裝詢價(jià)

干粉狀態(tài)可在0~4℃條件下低溫保藏。溶解后分裝為適當(dāng)體積，-20℃貯存。運(yùn)輸可在室溫下進(jìn)行。正確的貯存條件下，干粉狀態(tài)的有效期可達(dá)一年。液體狀態(tài)在-20℃有效期為半年。打開包裝使用后，如果在2~8℃環(huán)境下放置超過一周時(shí)間，建議過濾除菌或增加穩(wěn)定劑如0.5%疊氮化鈉，防止微生物污染。

貯存和稀釋緩沖液：50mM Tris-HCl緩沖液,2mM CaCl₂ (pH 8.0)。
反應(yīng)條件：反應(yīng)緩沖液中37-56℃溫育一小時(shí)

(1) 酶活測(cè)定

試劑準(zhǔn)備

試劑 I： 底物：1%牛奶乳酪蛋白溶液。1 g牛奶乳酪蛋白溶于50 ml 0.1 M磷酸鈉鹽溶液，pH 8.0，65-70 ℃水域孵育15 min攪拌溶解，自來水冷卻，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 8.0，定容100 ml。
試劑 II： TCA溶液：0.1 M三氯乙酸，0.2 M乙酸鈉，0.3 M乙酸，HCl調(diào)節(jié)pH 4.03，定容100ml。
試劑 III：0.4 M碳酸鈉溶液。
試劑 IV： 福林酚試劑：用水5倍稀釋。
試劑 V： 酶稀釋液：0.1 M磷酸鈉鹽溶液，pH 8.0。
試劑 VI： 酪氨酸溶液：1 μg/ml酪氨酸，0.2 M HCl溶解。

操作步驟

1．0.5 ml試劑I 37 ℃孵育10 min，加入0.5 ml酶液，混勻，37 ℃反應(yīng)10 min；
2．加入1 ml試劑II終止反應(yīng)，混勻，繼續(xù)孵育30 min；
3．離心反應(yīng)液；
4．取0.5 ml上清液，加入2.5 ml 試劑III，0.5 ml試劑IV，混勻后37 ℃孵育30 min；
5．660 nm 測(cè)定OD1；空白對(duì)照組：0.5 ml試劑V代替酶液，測(cè)定OD2；
6．0.5 ml試劑VI，2.5 ml 試劑III，0.5 ml試劑IV，混勻后37 ℃孵育30 min。660 nm 測(cè)定OD3；
空白對(duì)照組：0.5 ml 0.2 M HCI代替試劑VI，測(cè)值為OD4。

活力計(jì)算

公式說明：
2： 反應(yīng)液總體積（mL）；
0.5： 酶液體積（mL）；
10： 反應(yīng)時(shí)間（min）；
df： 稀釋倍數(shù)；
181.2： 酪氨酸分子量；
C： 酶濃度( mg/mL)。

結(jié)果比較

蛋白酶K特異活性
制造商	國(guó)外M品牌	Seebio
凍干產(chǎn)品活性 u/mg	33.5	49.5

 

結(jié)果: 蛋白質(zhì)純度超過 99% （激光掃描 SDS-PAGE膠）

結(jié)論：凍干粉正確儲(chǔ)存一年內(nèi)活性不變；液體酶酶活半年內(nèi)降低小于5%。

以Roche蛋白酶K和seebio蛋白酶K對(duì)比。

對(duì)比反應(yīng)條件：roche蛋白酶k 65℃ 10m； Seebio 蛋白酶k 65℃ 10m； Seebio蛋白酶K 55℃ 60m

以下結(jié)果QC符合要求。每管均為500ul全血。共3組對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)條件	得率
ROCHE65℃10m	33ug	19.2ug	5ug
SEEBIO65℃10m	30ug	20ug	4.8ug
SEEBIO55℃60m	30.4ug	18.5ug	5.4ug

全血提取DNA試劑盒電泳圖	全血提取DNA actin電泳圖
日期：2010.06.09 凝膠濃度：0.7％瓊脂糖RNA膠 上樣量：1ug/孔 電泳條件：U=105V T=15min 1. 090826-15（roche，65℃ 10m） 2. 090826-15（seebio，65℃ 10m） 3. 090826-15（seebio，55℃ 60m） 4. 090826-17（roche，65℃ 10m） 5. 090526-17（seebio，65℃ 10m） 6. 090826-17（seebio，55℃ 60m） 7. 090826-20（roche，65℃ 10m） 8. 090826-20（seebio，65℃ 10m） 9. 090826-20（seebio，55℃ 60m）	日期：2010.06.10 凝膠濃度：0.7％瓊脂糖DNA膠 上樣量：10ug/孔 電泳條件：U=95V T=15min 1. 090826-15（roche，65℃ 10m） 2. 090826-15（seebio，65℃ 10m） 3. 090826-15（seebio，55℃ 60m） 4. 090826-17（roche， 65℃ 10m） 5. 090526-17（seebio， 65℃ 10m） 6. 090826-17（seebio， 55℃ 60m） 7. 090826-20（roche， 65℃ 10m） 8. 090826-20（seebio， 65℃ 10m） 9. 090826-20（seebio， 55℃ 60m） －：Negative control ＋：Positive Control

結(jié)論：SEEBIO 蛋白酶K與ROCHE蛋白酶k實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在65℃水浴10m后得率及跑膠圖效果基本相同。可替代使用。

1. Kraus, E; et.al. Proteinase K from the Mold Tritirachium album limber, Specificity and Mode of Action. Z. Physiol. Chem., 357:939; 1976.
2. Jany,KD, et al. Amino Acid Sequence of Proteinase K from the Mold, Tritirachium album limber. Proteinase K; a Subtilisin-related Enzyme with Disulfide Bonds. FEBS Letter, 199,139.1986.
3. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Volume 3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, B.16.
4. Sweeney, P.J. and Walker, J.M. (1993) Enzymes of molecular biology. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 16, M.M. Burrell, ed., Humana Press, Inc., Totowa, NJ, 305.