有木有增加蛋白表達(dá)量的轉(zhuǎn)染試劑？ ——試試Seebio?小西家的陽離子聚合物PEI
CHO細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞常用于哺乳動物瞬轉(zhuǎn)系統(tǒng)中快速生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的蛋白。然而，研究者在利用瞬時轉(zhuǎn)染生產(chǎn)重組蛋白時，通常會遇到蛋白表達(dá)量極低，成本高昂且操作復(fù)雜不利于放大生產(chǎn)等問題。優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)染試劑是通往優(yōu)質(zhì)蛋白生產(chǎn)瞬轉(zhuǎn)平臺的必經(jīng)之路。
自1996年開始陽離子聚合物作為基因轉(zhuǎn)染載體的研究，聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）作為化學(xué)轉(zhuǎn)染的新寵，近年來倍受關(guān)注，無論是科研還是在工業(yè)化、大規(guī)模瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)重組蛋白或病毒載體領(lǐng)域都是使用廣泛的轉(zhuǎn)染試劑。西寶生物開發(fā)的新一代陽離子聚合物產(chǎn)品著重優(yōu)化和DNA結(jié)合能力。為了更好的了解PEI這款陽離子聚合物產(chǎn)品，本文從PEI的分類，原理，使用及常見問題及產(chǎn)品推薦幾個方面介紹該產(chǎn)品。
PEI的分類
PEI的結(jié)構(gòu)可以寫成是-(CH2CH2NH)n-。根據(jù)合成原料與工藝的差異，產(chǎn)物有支鏈PEI與直鏈PEI的差異，2者在應(yīng)用上存在比較明顯的偏好。支鏈PEI在力學(xué)性、加工性、成膜性、薄膜透光性方面更具有優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于造紙、石油、輕紡、建筑等領(lǐng)域，而直鏈PEI在真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染方面更具有優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染方面。
直鏈PEI，應(yīng)用最廣泛的主要有PEI25000與PEI40000（也有稱PEIMAX），在HEK293和CHO等細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率較高。PEI 40000與PEI 25000轉(zhuǎn)染試劑相比，具有很多優(yōu)點。包括：
1.溶解性：PEI 40000較易溶解，可直接在水中溶解，PEI 25000需要先把水調(diào)成弱酸性助其溶解，溶解后再用NaOH把pH調(diào)至中性；
2.操作性：PEI 40000操作簡便，更易于使用，且比PEI 25000的轉(zhuǎn)染效果好；
3.穩(wěn)定性：PEI 25000含有4-11%的丙酰基殘留，其能阻止聚合物主鏈與DNA結(jié)合。相較于PEI 25000，PEI 40000是完全脫落的結(jié)構(gòu)，因此其性能始終高效如一。
PEI轉(zhuǎn)染的原理
陽離子聚合物轉(zhuǎn)染的共同原理：聚合物把DNA包裹形成復(fù)合物，防止被DNase降解，然后附著在細(xì)胞膜上被內(nèi)吞進(jìn)入胞內(nèi)，破裂釋放后，DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，從而發(fā)揮一定的功能。陽離子聚合物和陽離子脂質(zhì)體的主要區(qū)別在于其不含疏水部分而完全溶于水，并可以方便地進(jìn)行化學(xué)修飾。
直鏈PEI單體中每3個原子含1個氮，形成胺基。每相隔二個碳原子，即每第三個原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的質(zhì)子海綿(proton sponge)體。這是PEI有較強(qiáng)的結(jié)合DNA和黏附細(xì)胞，能作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的重要原因。針對這個特點西寶生物開發(fā)的新一代陽離子聚合物產(chǎn)品著重優(yōu)化和DNA結(jié)合能力。
圖1. pH值與質(zhì)子化關(guān)系（源自：doi.org/10.1021/acs.macromol.0c01501）
PEI 能將 DNA 包裹成帶正電荷的微粒，這些微粒可以黏合到帶有負(fù)電荷的細(xì)胞表面殘基，并通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞，胺的質(zhì)子化導(dǎo)致反離子大量涌入以及滲透勢降低，在低pH環(huán)境中實現(xiàn)DNA胞內(nèi)釋放。普遍被接受的觀點是PEI上未質(zhì)子化的胺可以在與膜結(jié)合的細(xì)胞器（如溶酶體）中吸收氫離子，這將導(dǎo)致更多氫離子的流入，誘發(fā)滲透溶脹。而質(zhì)子化胺之間的排斥引起PEI構(gòu)象的改變，上述變化導(dǎo)致的滲透膨脹使囊泡釋放聚合物與 DNA 形成的復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。復(fù)合物拆解后，DNA 能自由的融合到細(xì)胞核中。
圖2. PEI轉(zhuǎn)染原理 (選自Current Protocols in Chemical Biology 9:147–157, September 2017)
產(chǎn)品優(yōu)勢
1.轉(zhuǎn)染效率高：適合轉(zhuǎn)染DNA，細(xì)胞密度在70%~80%時，轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到80%以上；
2.應(yīng)用范圍廣：既適用于HEK293等真核貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 也適用于懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，并且適用于有血清和無血清的轉(zhuǎn)染條件。
3.蛋白表達(dá)量高： 少量的轉(zhuǎn)染試劑獲得高產(chǎn)量的蛋白表達(dá)，性價比高，適用于大規(guī)模的轉(zhuǎn)染。
4.無機(jī)試劑，無動物源成分
5.低毒性：轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)良好并表達(dá)大量的目的蛋白；
6.產(chǎn)品穩(wěn)定，質(zhì)控嚴(yán)格；
不同細(xì)胞系參考數(shù)據(jù) 以48孔板為例（數(shù)據(jù)僅供參考）
|
細(xì)胞類型
|
培養(yǎng)體系
|
轉(zhuǎn)染時細(xì)胞匯合度
|
DNA
|
Seebio PEI（1mg/mL）
|
|
293H
|
DMEM
|
70-80%
|
0.2ug
|
0.2uL
|
|
293FT
|
DMEM
|
70-80%
|
0.2ug
|
0.6uL
|
|
293E
|
DMEM
|
70-80%
|
0.2ug
|
0.6uL
|
|
293F
|
DMEM
|
70-80%
|
0.2ug
|
0.6uL
|
|
COS7
|
DMEM
|
70-80%
|
0.2ug
|
0.6uL
|
|
hela
|
DMEM
|
70-80%
|
0.2ug
|
0.6uL
|
|
CaCO2
|
MEM
|
70-80%
|
0.2ug
|
0.9uL
|
|
BHK21
|
MEM
|
70-80%
|
0.2ug
|
0.6uL
|
|
RAW264.7
|
DMEM
|
70-80%
|
0.2ug
|
0.6uL
|
|
SW480
|
IMDM
|
70-80%
|
0.2ug
|
0.6uL
|
|
MDCK
|
DMEM
|
70-80%
|
0.2ug
|
1uL
|
|
CHO-K1
|
IMDM
|
70-80%
|
0.2ug
|
1uL
|
|
HepG2
|
DMEM
|
70-80%
|
0.2ug
|
0.6uL
|
|
A549
|
DMEM
|
70-80%
|
0.2ug
|
0.6uL
|
|
NIH/3T3
|
DMEM
|
70-80%
|
0.2ug
|
0.9uL
|
|
Vero
|
DMEM
|
70-80%
|
0.2ug
|
0.9uL
|
|
sf9
|
SIM SF
|
70-80%
|
0.2ug
|
0.9uL
|
不同培養(yǎng)體系參考值
|
培養(yǎng)皿
|
表面積(cm2)
|
培養(yǎng)基總量
|
DNA的量(ug)
|
轉(zhuǎn)染試劑的量(uL)
|
稀釋液體積(uL)
|
|
96孔板
|
0.3
|
100uL
|
0.1
|
0.3
|
10
|
|
48孔板
|
0.7
|
200uL
|
0.2
|
0.6
|
20
|
|
24孔板
|
1.9
|
500uL
|
0.5
|
1.5
|
50
|
|
12孔板
|
3.8
|
1mL
|
1
|
3
|
100
|
|
6孔板
|
10
|
2 mL
|
2
|
6
|
200
|
|
25cm2培養(yǎng)瓶
|
21
|
4 mL
|
4
|
12
|
400
|
|
75cm2培養(yǎng)瓶
|
58
|
10 mL
|
10
|
30
|
1000
|
轉(zhuǎn)染中的常見問題
1.轉(zhuǎn)染效率低
原因：(1)細(xì)胞活力：使用活力好傳代小于15代的細(xì)胞。
(2)細(xì)胞接種密度高/低：適當(dāng)降低/增加接種密度。
(3)PEI/DNA比率不合適：進(jìn)行不同基因轉(zhuǎn)染時應(yīng)對PEI和DNA的比例進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到合適比例。
(4)質(zhì)粒片段較大：可根據(jù)實際實驗需要調(diào)整，如適當(dāng)增加轉(zhuǎn)染質(zhì)粒總量等。
(5)混合方式不當(dāng)：質(zhì)粒DNA和PEI溶液混合時避免渦旋。同時要注意PEI加入 DNA溶液中的順序。
2.細(xì)胞毒性高
原因：(1)轉(zhuǎn)染液孵育時間過長：過長時間 PEI/DNA 復(fù)合體會導(dǎo)致細(xì)胞毒性。
(2)細(xì)胞接種密度低：適當(dāng)增加接種密度。
(3)PEI/DNA比例高：優(yōu)化合適的PEI和DNA的比例。
3.轉(zhuǎn)染效果不穩(wěn)定，重復(fù)性不好
原因： 轉(zhuǎn)染效果不穩(wěn)定一般與兩個因素緊密相關(guān)，一個是轉(zhuǎn)染試劑的穩(wěn)定性，另一個是基因的穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)按照說明書建議的保存溫度及條件進(jìn)行保存。溶解后則不建議反復(fù)凍融。如短時間內(nèi)連續(xù)使用，可放置于4℃保存。若超過10天不使用，不建議使用。
產(chǎn)品選擇指南
目前西寶生物（Seebio）提供了多種形式的轉(zhuǎn)染試劑，客戶可根據(jù)轉(zhuǎn)染核酸的種類/貼壁細(xì)胞/懸浮細(xì)胞等條件，選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑。具體選擇指南如下：
|
產(chǎn)品種類
|
核酸類型
|
細(xì)胞類型
|
是否可替換
|
|
Seebio®聚乙烯亞胺PEI（Polyethylenimine）轉(zhuǎn)染試劑 (貨號：AJL0115B)
|
DNA
|
貼壁細(xì)胞
懸浮細(xì)胞 |
可替換lipo3000，jet PEI
|
|
線性PEI轉(zhuǎn)染試MW25000(貨號：AJL0115C)
|
DNA
|
貼壁細(xì)胞
懸浮細(xì)胞 |
可替換PEI 25KTM(23966)
|
|
線性PEI轉(zhuǎn)染試劑(速溶型)MW40000(貨號：AJL0940B)
|
DNA
|
貼壁細(xì)胞
懸浮細(xì)胞 |
可替換PEI MAX 40K(24765)
|
訂購信息
即用型
|
品牌
|
貨號
|
產(chǎn)品名稱
|
規(guī)格
|
|
Seebio
|
Seebio®聚乙烯亞胺PEI（Polyethylenimine）轉(zhuǎn)染試劑
|
1ml
|
|
|
10ml
|
|||
|
50ml
|
|||
|
100ml
|
粉末非即用型
相關(guān)產(chǎn)品
平衡鹽及抗生素
|
品牌
|
貨號
|
產(chǎn)品名稱
|
規(guī)格
|
|
Seebio
|
Hanks平衡鹽粉劑(1×HBSS,含酚紅)
|
1L
|
|
|
Seebio
|
PBS緩沖液
|
500ml
|
|
|
WAKO
|
293-72601
|
D-PBS(-),Powder
|
1L×10
|
|
299-72603
|
10L
|
||
|
WAKO
|
Penicillin-Streptomycin Solution（×100）
青霉素-鏈霉素溶液（×100） |
100mL
|
|
|
WAKO
|
Penicillin-Streptomycin Solution（×50）
青霉素-鏈霉素溶液（×50） |
100mL
|
Seebio 293細(xì)胞專用培養(yǎng)基
|
產(chǎn)品編號
|
產(chǎn)品名稱
|
產(chǎn)品說明
|
規(guī)格
|
|
SeeHEK293CD01基礎(chǔ)培養(yǎng)基(液體)
|
(無動物源，化學(xué)成分限定,不含水解物，含微量生長因子)
|
1L
|
|
|
SeeHEK293CD01基礎(chǔ)培養(yǎng)基(干粉)
|
(無動物源，化學(xué)成分限定,不含水解物，含微量生長因子)
|
10L
|
|
|
100L
|
|||
|
SeeHEK293CD02基礎(chǔ)培養(yǎng)基(液體)
|
(無動物源，化學(xué)成分限定,不含水解物和生長因子)
|
1L
|
|
| SeeHEK293CD02基礎(chǔ)培養(yǎng)基(干粉) |
(無動物源，化學(xué)成分限定,不含水解物和生長因子)
|
10L
|
|
|
100L
|
|||
|
SeeHEK293CD03基礎(chǔ)培養(yǎng)基(液體)
|
原始培養(yǎng)基已經(jīng)含有4mM Gln
|
1L
|
|
|
SeeHEK293CD03,基礎(chǔ)培養(yǎng)基(干粉)
|
原始培養(yǎng)基已經(jīng)含有4mM Gln
|
10L
|
|
|
100L
|
|||
|
SeeHEK293FM01補料培養(yǎng)基(液體)
|
液體補料A含有60g/L的葡萄糖，補料B不含葡萄糖
|
1L+100ml
|
|
|
SeeHEK293FM01補料培養(yǎng)基(干粉)
|
液體補料A含有60g/L的葡萄糖，補料B不含葡萄糖
|
10L+1L
|
|
|
100L+10L
|
|||
|
Seebio®條件培養(yǎng)液(293T)
|
含有細(xì)胞分泌物的培養(yǎng)液
|
10ml
|
|
|
250ml
|
WAKO BalanCD 無血清細(xì)胞培養(yǎng)基
- cGMP級別
- 可以提供液體及粉末形式
- 無血清
- 已取得DMF
- 化學(xué)成分限定
- 適應(yīng)小試劑放大
HEK293系列：基因治療病毒載體生產(chǎn)，蛋白瞬時表達(dá) - 重組蛋白生產(chǎn)
|
貨號
|
產(chǎn)品名稱
|
規(guī)格
|
|
91165-1L
|
BalanCD HEK293
BalanCD HEK293培養(yǎng)基 |
1L
|
|
94137-10L
|
10L
|
|
|
94137-100L
|
100L
|
|
|
91166-500ML
|
BalanCD HEK293 Feed
BalanCD HEK293補料 |
500mL
|
|
981444-10L
|
10L
|
|
|
981444-100L
|
100L
|
防止細(xì)胞結(jié)團(tuán)
|
品牌
|
貨號
|
產(chǎn)品名稱
|
規(guī)格
|
|
WAKO
|
Sodium Dextran Sulfate 5,000 |
25g
|
|
|
WAKO
|
100g
|
||
|
WAKO
|
500g
|
||
|
WAKO
|
Sodium Dextran Sulfate 5,000 |
25g
|
|
|
WAKO
|
100g
|
||
|
WAKO
|
500g
|
消泡劑
|
品牌
|
貨號
|
產(chǎn)品名稱
|
規(guī)格
|
|
WAKO
|
Antifoam SI |
100ml
|
|
|
WAKO
|
500ml
|
||
|
WAKO
|
Antifoam PE-H |
100ml
|
|
|
WAKO
|
500ml
|
||
|
WAKO
|
Antifoam PE-M |
100ml
|
|
|
WAKO
|
500ml
|
||
|
WAKO
|
Antifoam PE-L |
100ml
|
|
|
WAKO
|
500ml
|
細(xì)胞解離
|
品牌
|
貨號
|
產(chǎn)品名稱
|
規(guī)格
|
|
WAKO
|
203-20251
|
Trypsin-EDTA Solution without Phenol Red, AF |
100ml
|
|
WAKO
|
207-20271
|
Trypsin-EDTA Solution (High Trypsin) without Phenol Red, AF |
100ml
|
WAKO細(xì)胞凍存
BAMBANKER 無血清細(xì)胞凍存液 用戶文獻(xiàn)眾多
|
產(chǎn)品編號
|
英文名稱
|
應(yīng)用
|
規(guī)格
|
|
BAMBANKER'
|
常規(guī)工具細(xì)胞，干細(xì)胞，PBMCs,免疫細(xì)胞，類器官等
|
120mL
|
|
|
306-14684
|
20mL×5
|
PRIME-XV 無DMSO 凍存液 無動物源成分，化學(xué)成分限定，已取得美國FDA DMF
|
產(chǎn)品編號
|
英文名稱
|
應(yīng)用
|
規(guī)格
|
|
91140-10ml
|
PRIME-XVFreezISDMSO free
|
干細(xì)胞
|
10mL
|
|
91140-100ml
|
100mL
|
iStock 無血清細(xì)胞凍存液 無異源，已取得日本《再生醫(yī)療等制品材料適格性確認(rèn)書》
|
產(chǎn)品編號
|
英文名稱
|
應(yīng)用
|
規(guī)格
|
|
385-19451
|
iStockXeno-Free Freezing medium
|
人免疫細(xì)胞，PBMCs,MSCs,iPS等
|
120mL
|
 |
 |
 |
| 官網(wǎng)：m.baichuan365.com | 微信服務(wù)號：iseebio | 微博：seebiobiotech |
 |
 |
 |
| 商城：mall.seebio.cn | 微信訂閱號：seebiotech | 泉養(yǎng)堂：www.canmedo.com |
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