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適用于靈長類 ES/iPS 細胞的玻璃化凍存液 StemCell Keep

來源：作者：人氣：-發表時間：2024-03-22 13:06:00【大中小】

適用于靈長類 ES/iPS 細胞的玻璃化凍存液

StemCell Keep

StemCell Keep 在保持高玻璃化能的同時，抑制了細胞毒性，是一款適用于靈長類 ES/iPS 細胞的玻璃化凍存液。

※本產品僅供研究使用，研究以外不可使用

◆關于 DAP213 等含有 DMSO 的保存液的問題

DMSO 作為普通細胞冷凍保護成分常被添加到保存液中，但同時也是對人體有害的成分，且極易被皮膚吸收。除具有細胞毒性外，如同下列論文所述，是影響細胞分化的因子之一。因此， DMSO 用于保存并不是十分理想的。現有的玻璃化凍存液 DAP213 中除了高濃度DMSO之外，還被指出含致癌性物質乙酰胺。除此之外，由于其溶質濃度高，還被指出會因為滲透壓引起毒性。

另外，使用 DAP213 時，若不能在 10~30 s 內完成保存，那么解凍后的存活率便會大幅下降，而 StemCell Keep 只需在是在約 1 min 內完成保存，且操作難度低，也不需要嫻熟的技術。

參考文獻

?使用 DMSO 將人骨髓白血病細胞株 HL-60 分化為粒細胞。

Jiang, G., et al., Int. Immunopharmacol., 6 (7), 1204～1213 (2006).

?使用DMSO將小鼠間充質干細胞分化為心肌細胞。

Young, D. A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 322 (3), 759～765 (2004).

?使用含有 DMSD 的保存液凍存人ES細胞發現未分化標記 Oct-4 的表達降低。

Katkov, I. I., et al., Cyobiology, 53 (2), 194～205 (2006).

◆玻璃化凍存法是什么

玻璃化凍存法是一種將細胞直接迅速浸沒到液氮中防止水結晶，并在非晶質的玻璃狀態下進行冷凍的方法。該方法的優點在于水的體積不會膨脹，因此給細胞帶來的損害較少。若采用一般冷凍法，靈長類ES/iPS細胞在解凍后的存活率較低，所以我們推薦使用玻璃化凍存法。然而，由于玻璃化需要較高的溶質濃度，存在細胞毒性容易因溶質變高的問題，因此低毒性凍存液的誕生備受期待。

◆關于靈長類ES/iPS細胞保存和玻璃化凍存法

靈長類ES/iPS細胞經不起冷凍
	● 使用一般的10%DMSO保存液緩慢冷凍（置于-80°C）時存活率較低 ● 細胞集落凍存后存活率僅為0.1~1%
建議使用玻璃化凍存法進行保存
	● 直接浸沒于液氮中防止水結晶化，在非晶質的玻璃狀態下冷凍的方法 ● 將細胞懸浮于玻璃化溶液中，然后立即將整個凍存管浸沒到液氮中，使其玻璃化 ● 該方法的優點在于水的體積不會膨脹，因此給細胞帶來的損害較少
傳統玻璃化凍存法的問題
	● 玻璃化需要較高的溶質濃度，容易因溶質提高毒性（滲透壓） ● 為防止水重結晶，必須迅速解凍 ● 需要嫻熟的技術
現有玻璃化凍存法的問題
	● 為小鼠受精卵玻璃化用而開發，以少量溶液（數μL）即可玻璃化為前提。若用于ES/iPS細胞而增加溶液量（約200 μL的話），則會導致玻璃化狀態不穩定，容易重結晶 ● 現有的玻璃化凍存液所含的乙酰胺具有致癌性，DMSO還會影響分化（Oct4表達降低），因此不受歡迎
優化玻璃化溶液開發StemCell Keep

◆特點

● 不含影響分化的DMSO以及動物蛋白成分

● 通過玻璃化法保存可在保持細胞集落狀態下進行凍存

● 可在維持干細胞多向分化能的狀態下進行（未分化狀態）凍存

● 在高安全性新型冷凍保護物質（專利申請中）的高度細胞保護作用以及玻璃狀態維持作用下，能夠更高效地凍存ES/iPS 細胞集落

● 按照使用方案使用的情況下，可保存100管

● 經無菌測試確認無細菌、真菌、支原體污染

● 本產品可在4°C下長期穩定保存（有效期2年）

※使用臺盼藍處理StemCell Keep保存的細胞時，請務必清洗細胞。

◆案例比較

人iPS細胞凍存

使用現有玻璃化冷凍液（DAP213）以及本產品凍存人iPS細胞一周，圖為解凍第二天的細胞集落形成率以及4天后的細胞數量（復蘇率）與非冷凍組形成的百分比。結果表明，使用本產品冷凍的組的保護效果明顯更好。

◆應用實例1

解凍使用本產品冷凍的人iPS細胞后的未分化標記表達

無論是（A）堿性磷酸酶（AP）、（B）OCT-4、（C）SSEA-4、（D）TRA-1-60都呈陽性，由此可知細胞維持了未分化狀態。

解凍使用本產品冷凍的人iPS細胞后的多能性評估

將解凍后的iPS細胞在未經處理的板上培養，制備胚狀體后，在普通的培養板上培養一周。檢測出了三胚層來源的蛋白。

◆應用實例2

使用本產品保存京都大學來源的人ES細胞（KhES1, KhES3）后進行培養，分析其各種生物標記物和表型。

無論是在SNL飼養細胞上（A、B）還是在涂布了Matrigel的板上（C、D）進行培養，ES細胞都有成長。

培養5日后，確認到AP（堿性磷酸酶）的表達。

將hES1細胞播種至SNL飼養細胞中分別培養3、4、5、6天后進行AP染色，測量細胞集落數。使用本產品保存的細胞第3天起形成細胞集落，直至第6天細胞集落逐漸變大。使用DAP213保存的細胞在第2天仍然很少，雖然第3天的細胞集落數與使用本產品保存的細胞的細胞集落數相同，但本產品的細胞集落更大。

將使用本產品冷凍的ES細胞解凍后，通過流式細胞術分析干細胞標記TRA-1-60的表達。

使用本產品保存的細胞與DAP213的Nanog表達水平幾乎相同。

圖中紫色部分為Nanog陽性細胞，綠色部分為對照細胞。

本產品保存量的97.6%，DAP213保存量的96.2%為陽性。

確認了使用本產品保存的細胞的細胞核類型（染色體類型）是否有變化。

通過RT-PCR分析各mRNA表達量時采用⊿⊿Ct法。結果顯示，當SOX2設置為1時，除了Nanog以外，本產品與DAP213在顯示hEs細胞的未分化能的轉錄因子和粘附因子的表達率相同。

◆應用實例3

人iPS細胞凍融過程中StemCell Keep和DAP213的對比研究（數據提供：山梨大學）

冷凍人iPS細胞時，建議使用DAP213的簡易玻璃化法。但是這個方法有著以下的問題：

● DAP213中含有的DMSO會抑制Oct3/4的表達。

● 乙酰胺具有致癌性

● DAP213可作為冷凍胚時的少量冷凍劑使用，但不適用于大容量的細胞保存。

● 添加DAP213后必須在15 s內浸沒到液氮中，需要嫻熟的技術。

關于人iPS細胞（201B7株，理研BRC）1，在添加StemCell Keep以及DAP213后，分別在15、45、90 s后浸沒到液氮中，并保存6天。解凍后，再培養6天，在此期間測量細胞的細胞集落密度、細胞集落大小、細胞集落面積率。

細胞集落密度

使用StemCell Keep冷凍的hiPS細胞的細胞集落密度與添加DAP213 15 s后進行冷凍處理的結果相同。使用DAP213冷凍的hiPS細胞的細胞集落形成明顯受浸沒前的時間長短影響，但使用StemCell Keep的細胞在解凍后的細胞集落形成幾乎不受影響（圖1、2）。

細胞集落大小

圖3、4為細胞集落大小。使用DAP213冷凍時的細胞集落比使用StemCell Keep冷凍時的細胞集落要小一些。高粘性的StemCell Keep抑制了移液時引起的水勢，結果表明，StemCell Keep的細胞集落與DAP213相比更穩定。

細胞集落面積率

由于hiPS細胞的細胞集落為單層的均一結構，因此細胞集落面積大小可直接反映細胞數。使用StemCell Keep冷凍的hiPS細胞的細胞集落占有面積率與添加DAP213 15 s后進行冷凍處理的結果相同。（圖5、6）。其中，即使在添加StemCell Keep45 s以及90 s后進行冷凍處理也幾乎沒有偏差，解凍后可穩定地恢復。

由于使用DAP213時，從添加到冷凍處理之間的時限很短，因此需要操作者嫻熟的技術。但是，使用StemCell Keep的話這些問題都能迎刃而解。因此，本次對比研究中，45 s的冷凍確保了充足的時間，并且證實了hiPS細胞解凍后可以充分恢復。另外，即使操作花費了90 s，穩定性雖然會下降但也可以充分恢復，可以盡可能地回避操作過程中發生始料不及的事故的風險。

但StemCell Keep也有著試劑粘性過高，難以提取以及混合等問題。在混合時，可以多花些時間，務必仔細徹底地混合5次左右。

※使用DAP213時，hiPS細胞的存活率約為20%。

參考文獻

1.Takahashi, K., et al., Cell, 131 (5), 861～872 (2007).

圖1：hiPS細胞細胞集落的密度

圖為每平方厘米左右的細胞集落數。

圖2：解凍后第6天的細胞集落密度（相對值）

圖為解凍后第6天hiPS細胞的細胞集落密度的相對值。顯示了添加DAP213 15 s后進行冷凍處理的hiPS細胞的細胞集落密度為1時的各細胞集落密度。

圖3：hiPS細胞細胞集落的大小

圖為培養中形成的細胞集落大小。

圖4：解凍后第6天的細胞集落大小（相對值）

圖為解凍后第6天hiPS細胞細胞集落大小的相對值。設添加DAP213 15 s后進行冷凍處理的hiPS細胞的大小為1作為相對值。

圖5：hiPS細胞細胞集落的面積占有率

圖為細胞集落面積相對于培養面積的比例。

圖6：解凍后第6天的細胞集落面積（相對值）

圖為解凍后第6天hiPS細胞細胞集落面積的相對值。設添加DAP21315 s后進行冷凍處理的hiPS細胞的面積為1作為相對值。

圖7：培養第6天的培養狀態

圖為培養第6天的hiPS細胞細胞集落的情況（40倍）。

◆操作步驟視頻

◆細胞解凍步驟視頻

◆操作方法概要

※請事先對目標細胞進行初步檢測。

※為獲得高存活率，當細胞懸浮于保存液后，需要立刻將vial浸沒到液氮中。請提前做好充分準備再開始操作。另外，解凍時，請將預先將加熱的培養基添加到vial中，迅速溶解更能提高細胞存活率。

冷凍

1. 在生物安全柜上準備好液氮。
2. 使用剝離液（0.25%胰蛋白酶 / 1 mg/mL膠原酶IV / PBS溶液）使靈長類ES/iPS細胞以細胞集落的形態剝離。
3. 離心2.中回收的細胞，去除培養基。若要冷凍多個時，請提前冷卻，逐個進行以下操作。
4. 添加200 μL本產品，仔細移液，蓋上蓋子后盡快（約1 min內）將vial整個浸沒在液氮中。
5. 儲存在液氮罐或-130°C的深冷柜中。

※當在60 mm的培養皿中合流時，則可冷凍1~5 vial左右。

※液體呈透明狀表明玻璃化良好。

右：正常玻璃化的案例

左：出現重結晶與渾濁的案例

解凍

1. 準備加熱至37°C的培養基，以及相應數量的加入了9 mL培養基的離心管。
2. 將使用本產品冷凍的細胞的凍存管放入杜瓦瓶等盛有液氮的容器中移至生物安全柜。
3. 將取出的凍存管的蓋子打開，迅速加入1 mL提前加熱的培養基，移液并溶解。
4. 將3.中的全部溶液轉移到1.中準備的加入了9 mL培養基的離心管中，離心并清洗。
5. 播種至飼養細胞上進行培養。

※解凍時請逐個解凍。

◆提供試用裝！

本產品提供小包裝試用裝。有意者請在專用申請表中填寫必要信息，提交給當地經銷商。