WakoPURE system采用世界首創的再構成系無細胞蛋白質合成技術,對于復制、翻譯及能量再生所需要的約30種因子進行調制、精制后,再加以重新構成。其中包括大 腸菌的翻譯因子--開始因子(IF1、IF2及IF3)、伸長因長(EF-G、EF-Tu及EF-Ts)、終結因子(RF1、RF2及RF3)、脂質體循 環因子、與20種氨基酸相對應的氨基酰tRNA合成酶、甲硫氨酸酰胺tRNA轉移酶、T7 RNA聚合酶等。此外,還包括脂質體、氨基酸、tRNA、能量源及能量再生系統。

 對于上述構成因子(脂質體蛋白質除外),均添加了組氨酸標簽。通過使用金屬新和樹脂,使反應所需的因子與目標蛋白質之外的構成因子相結合,再通過限外過濾即可除去樹脂結合因子與脂質體蛋白質。采用這種方法,可以在短時間內得到高純度、無標簽的目標蛋白質。

【特點】

● 通過逆反應用標簽系統,使蛋白質的精制變得更容易。
● 使天然序列蛋白質的精制更容易。
● 由于是重組系,因此不含有雜質蛋白質。
● 從合成到精制結束只需要三個小時。
● RNase污染極少。

【擴大反應規模】

采用WakoPURE system,可以根據需要擴大反應規模。單個產品為50μl。如使用多個產品,則可以實現蛋白質的大量合成。增加反應液并不會影響合成效率。

使用試劑盒中的二氫葉酸還原酶(DHFR)對照劑,在37°C條件下進行DHFR合成反應一小時后,對每一道使用5μl。然后進行SDS-PAGE,最后用SYPRO RED進行染色。

【Q&A】

Q: 所用的模板需要什么條件?

A: WakoPURE system可用于PCR產物或者質粒。但是,模板需要具備下列序列(亦可以是RNA)。

·開始密碼子:(ATG)

·終止密碼子:(TAG、TGA或TAA三者之一)

·在基因上流應有T7操縱子序列

·在開始密碼子的上流約10個堿基處應有脂質體結合部位(SD序列)

·在終止密碼子的下流應有6個堿基以上的序列(適用于PCR產物)

·在終止密碼子的下流應有復制終止子序列(適用于質粒DNA)

Q: 蛋白質合成量有多少?
A: 最大獲取量為100μg/ml。平均合成量為20~50μg。

編號	品名	容量
299-59501	WakoPURE System （體外蛋白質合成試劑盒）	4次用
295-59503		16次用

 <四次用試劑盒>

A溶液 .................................. 25μl×4支

B溶液 .................................. 10μl×4支

DHFR對照劑 ............................ 5μl×1支

通用啟發劑 .............................. 80μl×1支

 

<十六次用試劑盒>

A溶液 .................................. 25μl×16支

B溶液 .................................. 10μl×16支

DHFR對照劑 ..........................5μl×1支

通用啟發劑 .............................80μl×1支

 在 蛋白質組分析中,經常會使用質譜儀來進行蛋白質的鑒定及翻譯后的修飾。根據電離方法及分析儀的不同組合,質譜儀可以分為多種類型。在測定肽的質譜時,通常 會采用MALDI法(Matrix-assisted Laser Desorption Ionization,即基質輔助激光解附電離法)及ESI法(Electrospray Ionization,即電噴霧電離質譜法)。MALDI法的長處在于可以在短時間內對于多種樣品進行處理,而在使用串聯質譜儀獲取肽的序列信息時,則可 以采用ESI法。MLADI法是將樣本添加在一種被稱為基質(matrix)的化合物上,制成混合結晶,然后再用激光照射其表面以實現離子化。用作基質的 化合物可以是α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid)、芥子酸(Sinapic Acid,SA)或者2,5-二羥基苯甲酸(2,5-Dihydroxybenzoic Acid, DHB)。根據樣本的不同,可選用不同的基質。一般說來,CHCA適用于肽類樣品,SA適用于蛋白質樣品,而DHB則適用于肽、糖類及糖脂類樣品。但是, 對于市面上出售的基質產品,如果不進行任何處理而加以使用,則在質譜分析數據上會出現來源于基質的峰值,本底較高,信噪比較小。因此,對于這些基質,在使用前應進行再結晶處理,以盡可能除去源自基質的峰質。

編號	品名	用途	容量
037-19261	α-氰基-4-羥基肉桂酸 [CHCA]	蛋白質組分析用	50mg×5支
192-13361	芥子酸 [SA]	蛋白質組分析用	50mg×5支
044-29101	2,5-二羥基苯甲酸 [DHB]	蛋白質組分析用	50mg×5支

編號	品名	用途	容量
125-05061	賴氨酰肽鏈內切酶，質譜分析級	蛋白質組分析用	20μg×5支
202-15951	豬胰島素，質譜分析級	蛋白質組分析用	20μg×5支
293-57701	陰性膠片染色劑質譜分析套裝	電泳分析用	20次
299-58901	銀染試劑質譜分析套裝	電泳分析用	20次