LudgerTag™ 2-AB（2-氨基苯甲酰胺）多糖標(biāo)記試劑盒（貨號(hào)：LT-KAB-A2）包含經(jīng)胺化還原反應(yīng)使染料結(jié)合在多糖未結(jié)合還原端基的試劑，使用2-氨基苯甲酰胺（2-AB）標(biāo)記未結(jié)合多糖。
應(yīng)用：用2-氨基苯甲酰胺（2-AB）標(biāo)記未結(jié)合多糖
染料性質(zhì)
分子量 136.15
熒光 λex（染料） = 320 nm, λem = 420 nm
結(jié)構(gòu)
樣品數(shù)：通常每套標(biāo)記試劑較佳情況下可分析15個(gè)獨(dú)立樣品。
樣品量：每個(gè)樣品含25pmol到25nmol多糖。
適合檢測(cè)的樣品：帶有未結(jié)合還原末端的純化聚糖，都可以進(jìn)行標(biāo)記。
結(jié)構(gòu)完整性：未發(fā)現(xiàn)唾液酸、巖藻糖、硫酸鹽或磷酸鹽的損失（<2摩爾百分比）。
標(biāo)記效率：通常大于85%（取決于樣品）。
標(biāo)記選擇性：本質(zhì)上是化學(xué)計(jì)量標(biāo)記。
儲(chǔ)存：室溫下暗處儲(chǔ)存。遠(yuǎn)離熱源、避光和防潮。所供試劑至少可穩(wěn)定保存兩年。
運(yùn)輸：該產(chǎn)品可在室溫下運(yùn)輸。
處置：使用時(shí)涉及的玻璃或塑料器皿以及溶劑，應(yīng)確保不含糖化酶及外源性碳水化合物。在所有樣品處理時(shí)，使用無(wú)粉末手套，避免受到外源性碳水化合物的污染。標(biāo)記試劑設(shè)計(jì)的所有步驟都必須在干燥環(huán)境下操作，并使用干燥的玻璃和塑料器皿。一旦打開(kāi)試劑瓶，應(yīng)立即使用。多余試劑根據(jù)當(dāng)?shù)匕踩?guī)則丟棄。
安全：僅供研究用。不得用于人體或藥用。請(qǐng)閱讀安全數(shù)據(jù)表（SDS）了解所有相關(guān)化學(xué)品。標(biāo)記試劑涉及的操作，都應(yīng)配備使用適當(dāng)?shù)膫€(gè)人安全保護(hù)裝置 - 眼鏡、耐化學(xué)性手套（如 腈類(lèi)手套），以及在實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)柜進(jìn)行操作。
試劑盒組成
每個(gè)標(biāo)記試劑盒包括1瓶以下試劑:
| Cat. | # Item | Quantity |
| LT-2AB-01 | 2-AB染料 (2-氨基苯甲酰胺) | 5 mg |
| LT-DMSO-01 | 二甲基亞砜 DMSO | 350 μl |
| LT-ACETIC-01 | 冰醋酸 | 500 μL |
| LT-CYANOB-01 | 氰基硼氫化鈉(還原劑) | 6 mg |
所需的其他試劑和設(shè)備
- 加熱模塊、爐或相近功能的干熱器（不能使用水浴），設(shè)定在65°C
- 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（例如Savant, Heto, 或其它）
- 反應(yīng)小瓶 (e.g. 聚丙烯 微量離心瓶)
- 注：如果進(jìn)行樣品標(biāo)記后洗滌（參見(jiàn)樣品洗滌部分），則需要其它試劑。
標(biāo)記操作時(shí)間線
LudgerTag 標(biāo)記過(guò)程,加上可選樣品標(biāo)記后洗滌，通常需要4-5個(gè)小時(shí)：
| 過(guò)程 | 時(shí)間 | 總時(shí)間（小時(shí)） |
| 樣品轉(zhuǎn)移到反應(yīng)瓶并干燥 | 30分鐘 | 0.5 |
| 配置并加入標(biāo)記試劑 | 15分鐘 | 0.75 |
| 樣品和試劑一起培養(yǎng) | 3 小時(shí) | 3.75 |
| 標(biāo)記后洗滌 | 1小時(shí) | 4.75 |
還原性胺化
標(biāo)記反應(yīng)涉及一個(gè)兩步反應(yīng)過(guò)程。 (見(jiàn)圖1):
1.希夫堿生成
具有未結(jié)合還原末端的多糖，其末端在閉環(huán)（有環(huán)）和開(kāi)環(huán)（無(wú)環(huán)）狀態(tài)之間處于平衡狀態(tài)。染料的伯胺對(duì)無(wú)環(huán)還原端基殘基的羰基碳進(jìn)行親核進(jìn)攻，形成部分穩(wěn)定的席夫堿。
2. 希夫堿還原
希夫堿亞胺基通過(guò)化學(xué)還原生成穩(wěn)定標(biāo)記的多糖。
圖1:通過(guò)還原性胺化反應(yīng)，用2-氨基苯甲酰胺標(biāo)記多糖
標(biāo)記操作概述
LudgerTag 多糖標(biāo)記試劑盒，用于熒光或發(fā)色標(biāo)記帶有為結(jié)合還原端基的多糖。在所中色譜和結(jié)構(gòu)序列分析中，經(jīng)標(biāo)記的多糖既可以進(jìn)行高靈敏度熒光檢測(cè)，也可以進(jìn)行紫外吸收監(jiān)測(cè)，包括使用LudgerSep液相色譜柱的色譜分析和使用外切糖苷酶的序列分析（參見(jiàn) 參考1-5, 7)。
標(biāo)記過(guò)程概述如下：
1 多糖準(zhǔn)備
準(zhǔn)備多糖樣品，去除類(lèi)似鹽和洗滌劑等可能干擾標(biāo)記過(guò)程的污染物。
2 多糖干燥
將樣品置于反應(yīng)小瓶中干燥。
3 標(biāo)記試劑準(zhǔn)備
將試劑盒中相關(guān)試劑混合制備新鮮的染料標(biāo)記溶液。
4 將標(biāo)記試劑加入多糖中
將小量的標(biāo)記溶液加入每一份多糖樣品中
5 培養(yǎng)
培養(yǎng)樣品使標(biāo)記反應(yīng)進(jìn)行下去。
6 標(biāo)記后洗滌
培養(yǎng)完成后，如有必要（根據(jù)后續(xù)分析過(guò)程而定），直接進(jìn)入洗滌流程以去除過(guò)量的標(biāo)記試劑。.
7 經(jīng)標(biāo)記的多糖儲(chǔ)存或者分析
經(jīng)標(biāo)記的多糖樣品現(xiàn)在可以用于分析了。
樣品準(zhǔn)備
要進(jìn)行標(biāo)記的多糖樣品，無(wú)論是純化的或是多糖混合物，必須包含未結(jié)合的還原端基，顆粒狀且不含無(wú)機(jī)鹽，并溶于易揮發(fā)的溶劑體系中（建議是純水）。
下列物質(zhì)可能干擾標(biāo)記反應(yīng)，必須在進(jìn)行LudgerTag™ 標(biāo)記之前，事先從多糖樣品中去除：
不揮發(fā)溶劑
不揮發(fā)鹽，尤其是過(guò)渡金屬離子
洗滌劑
染料和染色劑，例如考馬斯藍(lán)
不揮發(fā)鹽，尤其是過(guò)渡金屬離子
洗滌劑
染料和染色劑，例如考馬斯藍(lán)
Ludger提供了一系列LudgerClean™試劑盒，用于在Ludgertag™標(biāo)記之前洗滌多糖樣品。這些內(nèi)容在LudgerClean多糖洗滌指南[參考6]中有詳細(xì)說(shuō)明。
標(biāo)準(zhǔn)樣品制備概述如下：
1 多糖純化
如有必要，從樣品中按照多糖洗滌指南[參考6]中所述去除非碳水化合物污染物。
2 將樣品轉(zhuǎn)移至反應(yīng)小瓶中
從典型糖蛋白中獲得的多糖，樣品量應(yīng)在100個(gè)皮摩爾-50納米摩爾的范圍內(nèi)。單一的純多糖，即使僅有5皮摩爾的量，也可以被標(biāo)記，并在之后高效液相色譜分析中檢測(cè)出。適用的反應(yīng)小瓶，包括小型聚丙烯微離心管和可用于PCR操作的試管。
3 樣品干燥
理論上，應(yīng)使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器干燥樣品。如果條件不允許，可以小心使用冷凍干燥（尤其要確保在小瓶的底部的樣品，凍干成小而致密的物質(zhì)）。 不要將樣品置于高溫（>28℃）或極端pH環(huán)境下，因?yàn)檫@樣會(huì)導(dǎo)致唾液酸在酸催化下耗損（高溫、強(qiáng)酸），或多糖還原端的異構(gòu)反應(yīng)（強(qiáng)堿）。
標(biāo)記試劑準(zhǔn)備
按如下過(guò)程制備新鮮標(biāo)記試劑：
4 制備DMSO-醋酸混合液
150μl冰醋酸加入盛有DMSO的小瓶中，并用移液器抽吸混合。
冰醋酸和DMSO的貨號(hào)分別為L(zhǎng)T-ACETIC-01和 LT-DMSO-01。
小心敲擊安瓿瓶以震落附著安瓿上半部的內(nèi)容物，然后小心打開(kāi)安瓿瓶。
如果DMSO凍成固體，在烘箱或加熱快上在30-65℃之間緩慢加熱小瓶（在啟封前）。
5 加入染料
將100μl DMSO-醋酸混合液加入LudgerTag™ 2-AB (2-氨基苯甲酰胺) 染料小瓶中，混合直至染料全部溶解。
染料貨號(hào)為L(zhǎng)T-2AB-01。
6 加入還原劑
將溶解的染料加入盛有LudgerTag™ 氰基硼氫化鈉 (還原劑) 的小瓶中，使用移液器抽吸混合直至還原劑全部溶解形成最終的標(biāo)記試劑。
氰基硼氫化鈉還原劑的貨號(hào)是LT-CYANOB-01。
如果還原劑難以溶解，那么在65℃的恒溫培養(yǎng)箱中，或者加熱塊上，輕緩地加熱至多4分鐘。如還原劑仍未全溶，補(bǔ)加10μl純水并混合均勻。
標(biāo)記試劑應(yīng)防潮，并在配置60分鐘內(nèi)使用。
標(biāo)記反應(yīng)
7 將標(biāo)記試劑加入樣品
將5μl標(biāo)記試劑加入到每一份經(jīng)干燥的多糖樣品中，蓋上離心管，徹底混合，然后輕輕敲擊以確保標(biāo)記溶液位于小瓶的底部。
8 培養(yǎng)
將反應(yīng)小瓶放在65℃的加熱塊、砂浴或烘箱中，培養(yǎng)3小時(shí)。
培養(yǎng)必須在干燥的環(huán)境下進(jìn)行。請(qǐng)使用培養(yǎng)箱或干燥塊，請(qǐng)務(wù)必不要使用水浴。
樣品必須全部溶解在標(biāo)記溶液中，才能有效進(jìn)行標(biāo)記。為了促進(jìn)全部溶解，樣品可在培養(yǎng)溫度達(dá)到65℃后渦旋混合30分鐘，然后繼續(xù)培養(yǎng)。
在大多數(shù)情況下，培養(yǎng)時(shí)間可以縮短至2小時(shí)或延長(zhǎng)至4小時(shí)，而不會(huì)顯著改變標(biāo)記反應(yīng)結(jié)果。
9 離心并冷卻
培養(yǎng)結(jié)束后取出樣品，短暫離心微量試管，并讓其全部冷卻至室溫。
LudgerClean™ S 標(biāo)記后樣品洗滌
對(duì)于特定的應(yīng)用 - 例如后續(xù)的HPLC分析，標(biāo)記后的樣品洗滌(去除多余的染料和其它標(biāo)記試劑) 是必不可少的。使用LudgerClean™ S 小柱 (貨號(hào) LC-S-Ax, 此處x代表試劑盒中小柱的數(shù)量)按試劑盒所附標(biāo)準(zhǔn)操作程序可以完成樣品洗滌。
對(duì)于過(guò)量標(biāo)記試劑不會(huì)影響后續(xù)樣品分析的應(yīng)用而言，樣品標(biāo)記后洗滌并非必需。這些分析手段包括碳水化合物電泳，游離染料會(huì)從標(biāo)記多糖條帶處分離開(kāi)。
LudgerTag™ 2AA標(biāo)記多糖的分析
LudgerTag™ 2-AB標(biāo)記多糖可通過(guò)一系列分析方法進(jìn)行研究，包括HPLC，凝膠電泳和質(zhì)譜。 這些會(huì)在參考資料8里詳細(xì)敘述，在下文也有概述。
高壓液相色譜分析
LudgerTag™ 2-AB標(biāo)記多糖混合物可以通過(guò)一系列HPLC（高壓液相色譜）方法進(jìn)行分離和分析，也包括LudgerSep HPLC:
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分析類(lèi)型 |
柱子 |
貨號(hào) |
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帶電荷和中性多糖的分離 |
LudgerSep™ C |
LS-C-01 |
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帶電荷和中性多糖的剖面分析 |
LudgerSep™ N |
LS-N-01 |
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中性多糖的分離 |
LudgerSep™ R 我要下單
熱點(diǎn)推薦蛋白酶K (源自林伯氏白色念球菌)茚三酮顯色溶液套裝，日立分析儀專(zhuān)用 (299-70501)氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,AN-2型 (011-14463)表面潤(rùn)濕張力試驗(yàn)用混合液 Wetting Tension Test MixtureStemSure(R) 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基 網(wǎng)友熱評(píng) |