茶多糖（Tea polysaccharides，簡稱TPS）是茶葉中具有特殊生物活性的一類與蛋白質結合在一起的酸性多糖或酸性糖蛋白。藥理研究表明，茶多糖具有顯著的降血糖效果和免疫活性，使茶多糖有望成為預防與治療糖尿病和心血管疾病、提高免疫功能的天然藥物。近年來，大多數研究表明茶葉中茶多糖的重要功能，但在茶多糖的檢測方面，高效、便捷、快速的方法還很欠缺。
離子色譜法測定糖類逐漸被學者們所關注，鑒于糖類化合物分子具有電化學活性和在強堿溶液中呈離子化狀態，Roxklin等于1983年首先報道了用陰離子交換色譜柱分離，脈沖安培檢測器測定糖的新方法。本文運用溫水浸提，乙醇沉淀，超聲輔助乙酸水解法，方便、高效的提取了茶葉中的多糖，并以NaOH溶液作為流動相，研究了用離子交換色譜分離-脈沖安培檢測半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖的方法。
1 實驗部分：
1.1 儀器和試劑
儀器：瑞士萬通公司（Metrohm）861 Advanced Compact IC，817 Bioscan脈沖安培檢測器，833 IC Liquid Handing Unit蠕動泵，METROSEP CARB 1（150×4.0mm）陰離子交換柱，色譜工作站為Metrohm IC-Net 2.3。
試劑：半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖標樣，綠茶，普洱茶，烏龍茶，紅茶。
1.2 色譜條件
分離柱：METROSEP CARB 1（150×4.0 mm）陰離子交換柱，淋洗液：6 mmol/L NaOH溶液，流速：1.0 mL/min，進樣量：20 μL，柱溫：32℃，再生液：200 mmol/L NaOH。
1.3 標準溶液和樣品溶液的配制
（1）標準溶液的配制：
稱取半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖標樣0.10g，分別溶于100mL容量瓶中，配制成1000mg/L標準儲備液。
超純水稀釋儲備液分別配制半乳糖、葡萄糖、甘露糖濃度為2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、
40.0 mg/L和果糖濃度為4.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L的標準溶液。
（2）樣品溶液的配制：
A．粗多糖的提取：
分別取20 g綠茶、普洱茶、烏龍茶、紅茶粉碎后，水浴加熱250 mL溫水浸提120 min，超聲波輔助浸提，用布氏漏斗抽濾后，濾液用旋轉蒸發儀減壓濃縮，溫度控制在70℃，濃縮至10 mL左右，用三倍體積95%乙醇沉淀，放置冰箱冷藏，靜置過夜后抽濾，沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚交替洗滌2次，放置于恒溫箱中低溫干燥至恒重（70℃）。
B．粗多糖的水解：
本實驗利用超聲輔助乙酸水解法，分別稱取上述四種茶葉粗多糖0.2 g，用50 mL1mol/L
乙酸水解，超聲波作用時間為120 min。同時嘗試了直接用水水解，但試驗效果不佳。
2 結果與討論
2.1 淋洗液的選擇：
調節淋洗液NaOH濃度分別為1.0、2.0、5.0、6.0、7.5、10.0、15.0、20.0、50.0、100.0、
200.0 mmol/L，分析含有半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖4種單糖的標準溶液。由于半乳糖、
葡萄糖和甘露糖屬于差相異構體和位置異構體，流動相的濃度應小于20.0 mmol/L，才可使這三種單糖達到分離。通過對比發現在NaOH濃度為6.0 mmol/L時，4種單糖峰分離效果好，且保留時間適中。但是，在低濃度的條件下，由于脈沖安培檢測器是在堿性條件下（pH>12）的電化學響應下實現的，所以檢測的靈敏度降低，重現性變差，且每次進樣前色譜柱需要再生處理，用高濃度氫氧化鈉（200.0 mmol/L）平衡柱子。
2.2 標準曲線的繪制與最低檢測限的測定
在優化的分離測定條件下，分析標準溶液，以峰高定量，其分離情況見圖1。
圖1 4種單糖標準樣品的色譜圖（半乳糖、葡萄糖、甘露糖20 mg/L，果糖30mg/L）
以單糖的色譜峰高（Y）對其質量濃度（X，mg/L）進行線性回歸，標準曲線見圖2~5，
得到線性回歸方程。半乳糖為：Y=46.07467X+39.26354，R=0.99908；葡萄糖為：
Y=39.83798X+31.67077，R=0.99941；甘露糖為：Y=20.09056X-73.50196，R=0.99972；果糖為：Y=1.85911X+3.46878，R=0.99973。線性范圍為2.0~50.0 mg/L。進一步稀釋質量濃度為2mg/L的標準溶液測定其最低檢測限，得到最低檢測限為0.125mg/L~2.0mg/L
2.3 重現性試驗
取20 mg/L的半乳糖、葡萄糖、甘露糖和30 mg/L的果糖混合液適量，按照上述優化后的色譜條件分別連續進樣7次，得4種單糖峰高測定值的相對標準偏差（RSD）如下：半乳糖為：6.10%、葡萄糖為：5.82%、甘露糖為：14.19%、果糖為：9.88%。4種單糖保留時間的RSD如下：半乳糖為：2.12%、葡萄糖為：2.03%、甘露糖為：2.25%、果糖為：2.26%。
2.4 樣品測定和加標回收率試驗
準確稱取綠茶粗多糖20 mg、移取普洱茶、烏龍茶、紅茶粗多糖水解液5mL各三份，向其中分別依次加入20 mg/L混標溶液2.5 mL；4種單糖的標準儲備液半乳糖、葡萄糖、甘露糖0.1 mL，果糖0.2 mL；40mg/L混標溶液5 mL。并定容至10 mL。按照優化后的色譜條件進行色譜分析，計算加標回收率，結果如表1示，樣品色譜圖見圖2~5。
表1 樣品測定和回收率的試驗結果
3 結論
本研究建立了高效離子交換分離-脈沖安培檢測多糖中半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖的方法。方法靈敏度高，準確性好，操作簡單。但在果糖的測定上還存在一定的欠缺，且試驗穩定性差，可以進一步研究改善。將該法用于實際樣品的測定，實用性強。
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