總及游離三碘甲狀腺原氨酸（TT3及FT3）-磁微粒化學(xué)發(fā)光法（AE/AP）/熒光免疫層析解決方案（雙抗體夾心法）

來源：作者：人氣：-發(fā)表時(shí)間：2025-01-22 13:31:00【大中小】

1.項(xiàng)目背景

1.1臨床意義

摘自《總?cè)饧谞钕僭彼釞z測試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》

三碘甲狀腺原氨酸（3,5,3’-L-三碘甲狀腺原氨酸，T3）是由甲狀腺合成和分泌（占大約20%）或由甲狀腺素在5’位脫碘轉(zhuǎn)化而來（占大約80%）的一種激素，分子量為651Da，是目前已知生物活性最強(qiáng)的甲狀腺激素，其生物活性為甲狀腺素（T4）的3～5倍。在血液循環(huán)中，99.7%的T3與結(jié)合蛋白結(jié)合，發(fā)揮生理活性的是游離的T3（FT3）。游離T3檢測對(duì)疾病診斷的靈敏度和特異性較好，但相對(duì)總T3而言更容易受到一些疾病和藥物的干擾導(dǎo)致結(jié)果假性偏高或偏低，此時(shí)總T3檢測結(jié)果更能準(zhǔn)確反映體內(nèi)三碘甲狀腺原氨酸的狀態(tài)。總?cè)饧谞钕僭彼幔═T3）是指血清或血漿中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)三碘甲狀腺原氨酸的總和，在臨床上主要用于輔助診斷甲狀腺功能亢進(jìn)癥（簡稱甲亢）、甲狀腺功能減低癥（簡稱甲減）及其臨床療效的評(píng)價(jià)等。

TT3在正常和病理狀態(tài)下的水平特點(diǎn)，不同類型疾病、不同人群（例如年齡、性別、妊娠情況等）的TT3水平差異。詳細(xì)說明測定TT3水平對(duì)相關(guān)疾病的臨床指導(dǎo)意義。

TT3升高見于：

①甲亢，包括原發(fā)性/繼發(fā)性甲亢、T3型甲亢；

②亞急性甲狀腺炎和無痛性甲狀腺炎；

③促甲狀腺激素（TSH）不適當(dāng)分泌綜合征。

TT3降低見于：

①甲減；

②甲狀腺切除術(shù)后；

③應(yīng)用雄激素、糖皮質(zhì)激素、生長激素等藥物引起TBG降低。

FT3的檢測理論上不受結(jié)合蛋白濃度和結(jié)合力特性的影響，因此不需要額外進(jìn)行反映結(jié)合參數(shù)類項(xiàng)目的檢測(如T-uptake，TBG)。因此，F(xiàn)T3的測定是臨床常規(guī)評(píng)估甲狀腺功能的重要指標(biāo)。FT3的測量結(jié)果可作為甲狀腺疾病鑒別診斷的依據(jù)，被用來區(qū)分不同類型的甲亢，以及確診T3甲狀腺毒癥。

1.2小分子雙抗體夾心法

2024年公開專利CN117871874A《小分子物質(zhì)免疫檢測方法》對(duì)小分子夾心法的反應(yīng)原理做了詳細(xì)闡述，摘抄部分內(nèi)容如下。

本發(fā)明提出了一種小分子物質(zhì)免疫檢測方法，其特征在于，包括：（1）將含有小分子物質(zhì)的樣本、配體、第二抗體和表面活性劑進(jìn)行反應(yīng)，得到小分子物質(zhì)-配體-第二抗體三元復(fù)合物，且所述小分子物質(zhì)-配體-第二抗體三元復(fù)合物中小分子物質(zhì)誘導(dǎo)配體形成至少一個(gè)新的構(gòu)象表位，所述第二抗體可特異性結(jié)合所述至少一個(gè)新的構(gòu)象表位，所述表面活性劑可消除所述第二抗體與構(gòu)象未改變的配體之間的結(jié)合；（2）檢測所述小分子物質(zhì)-配體-第二抗體三元復(fù)合物。

樣本中的小分子物質(zhì)與配體發(fā)生特異性結(jié)合，得到小分子物質(zhì)-配體復(fù)合物，并且小分子物質(zhì)-配體復(fù)合物中小分子物質(zhì)誘導(dǎo)配體形成至少一個(gè)新的構(gòu)象表位。小分子物質(zhì)-配體復(fù)合物與第二抗體和表面活性劑反應(yīng)，第二抗體特異性地與形成新構(gòu)象表位的配體結(jié)合，同時(shí)也會(huì)與構(gòu)象未改變的配體產(chǎn)生弱結(jié)合。表面活性劑可消除第二抗體與構(gòu)象未改變的配體之間的結(jié)合，得到小分子物質(zhì)-配體-第二抗體三元復(fù)合物。通過檢測三元復(fù)合物，可以實(shí)現(xiàn)小分子物質(zhì)檢測。由此，采用雙抗體夾心法可以提高檢測準(zhǔn)確性和靈敏度，不同濃度梯度樣本檢測區(qū)分度高。同時(shí)，減少了篩選高特異性復(fù)合物抗體的難度，更有利于小分子物質(zhì)檢測試劑盒的大規(guī)模生產(chǎn)和檢測，應(yīng)用價(jià)值高。

2. 性能表現(xiàn)

針對(duì)TT3/FT3的檢測（夾心法），西寶生物推出3種抗體及2種解離劑。

具體性能如下（以下評(píng)估僅代表在西寶生物的工藝體系下的驗(yàn)證，建議客戶根據(jù)自身工藝進(jìn)行更為詳細(xì)的驗(yàn)證）。

2.1化學(xué)發(fā)光（AE）平臺(tái)

組合1（TT3）：T3抗體（貨號(hào)：EKY0323G）包被羧基磁珠+T3復(fù)合物抗體（貨號(hào)：EKY0323H）標(biāo)記吖啶酯+TT3解離劑（發(fā)光專用）（貨號(hào)：DCH0208A）；

線性范圍：0.195ng/mL-6.51ng/mL；最低檢出限：0.195ng/mL。

組合1（FT3）：T3抗體（貨號(hào)：EKY0323F）包被羧基磁珠+T3復(fù)合物抗體（貨號(hào)：EKY0323H）標(biāo)記吖啶酯；

線性范圍：0.26pg/mL-32.55pg/mL；最低檢出限：0.26pg/mL。

2.2化學(xué)發(fā)光（AP）平臺(tái)

組合2（TT3）：T3抗體（貨號(hào)：EKY0323G）包被羧基磁珠+T3復(fù)合物抗體（貨號(hào)：EKY0323H）標(biāo)記堿性磷酸酶+TT3解離劑（發(fā)光專用）（貨號(hào)：DCH0208A）；

線性范圍：0.195ng/mL-6.51ng/mL；最低檢出限：0.195ng/mL。

組合2（FT3）：T3抗體（貨號(hào)：EKY0323F）包被羧基磁珠+T3復(fù)合物抗體（貨號(hào)：EKY0323H）標(biāo)記堿性磷酸酶；

線性范圍：0.26pg/mL-32.55pg/mL；最低檢出限：0.26pg/mL。

2.3熒光免疫層析平臺(tái)

組合3（TT3）：T3抗體（貨號(hào)：EKY0323G）標(biāo)記熒光微球+T3復(fù)合物抗體（貨號(hào)：EKY0323H）劃膜+TT3解離劑（層析專用）（貨號(hào)：DCH0208B）；

線性范圍：0.50ng/mL-6.51ng/mL；最低檢出限：0.50ng/mL。

組合3（FT3）：T3抗體（貨號(hào)：EKY0323G）標(biāo)記熒光微球+T3復(fù)合物抗體（貨號(hào)：EKY0323H）劃膜；

線性范圍：1pg/mL-32.55pg/mL；最低檢出限：1pg/mL。

3.臨床相關(guān)性

3.1化學(xué)發(fā)光（AE）平臺(tái)：

3.1.1 西寶生物發(fā)光（AE）平臺(tái)TT3抗體配對(duì)組合1與羅氏診斷的TT3試劑（電化學(xué)發(fā)光法）賦值的臨床樣本相關(guān)性R²＞0.90，相關(guān)性較好；

3.1.2西寶生物發(fā)光（AE）平臺(tái)FT3抗體配對(duì)組合1與羅氏診斷的FT3試劑（電化學(xué)發(fā)光法）賦值的臨床樣本相關(guān)性R²＞0.95左右，相關(guān)性良好。

3.2化學(xué)發(fā)光（AP）平臺(tái)：

3.2.1西寶生物發(fā)光（AP）平臺(tái)TT3抗體配對(duì)組合2與羅氏診斷的TT3試劑（電化學(xué)發(fā)光法）賦值的臨床樣本相關(guān)性R²＞0.90左右，相關(guān)性較好；

3.2.2西寶生物發(fā)光（AP）平臺(tái)FT3抗體配對(duì)組合2與羅氏診斷的FT3試劑（電化學(xué)發(fā)光法）賦值的臨床樣本相關(guān)性R²＞0.95，相關(guān)性良好。

3.3熒光免疫層析平臺(tái)：

3.3.1 西寶生物熒光免疫層析平臺(tái)TT3抗體配對(duì)組合3與羅氏診斷的TT3試劑（電化學(xué)發(fā)光法）賦值的臨床樣本相關(guān)性R²＞0.95，相關(guān)性良好。

3.3.2 西寶生物熒光免疫層析平臺(tái)FT3抗體配對(duì)組合3與羅氏診斷的FT3試劑（電化學(xué)發(fā)光法）賦值的臨床樣本相關(guān)性R²＞0.95，相關(guān)性良好。

4. 測試方案

4.1化學(xué)發(fā)光（AE）平臺(tái)

4.1.1 TT3抗體配對(duì)組合1

樣本:樣品加樣量20ul；

試劑1：T3抗體（貨號(hào)：EKY0323G）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；

試劑2：T3復(fù)合物抗體（貨號(hào)：EKY0323H）標(biāo)記-吖啶酯稀釋物，用量50ul/測試；

試劑3：TT3解離劑（發(fā)光專用）（貨號(hào)：DCH0208A）。

反應(yīng)條件：

第一步：20ul樣本+50ul試劑1+50ul試劑3，37℃孵育10min，清洗；

第二步：加入50ul 試劑2，37℃孵育10min，清洗；

第三步：加入預(yù)激發(fā)液及激發(fā)液，進(jìn)行測試。

4.1.2 FT3抗體配對(duì)組合1

樣本:樣品加樣量20ul；

試劑1：T3抗體（貨號(hào)：EKY0323F）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；

試劑2：T3復(fù)合物抗體（貨號(hào)：EKY0323H）標(biāo)記-吖啶酯稀釋物，用量50ul/測試；

反應(yīng)條件：

第一步：20ul樣本+50ul試劑1，37℃孵育10min，清洗；

第二步：加入20ul 試劑2，37℃孵育10min，清洗；

第三步：加入預(yù)激發(fā)液及激發(fā)液，進(jìn)行測試。

測試使用發(fā)光儀器:科斯邁SMART 500S。

4.2化學(xué)發(fā)光（AP）平臺(tái)

4.2.1 TT3抗體配對(duì)組合2：

樣本:樣品加樣量10ul；

試劑1：T3抗體（貨號(hào)：EKY0323G）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；

試劑2：T3單復(fù)合物抗體（貨號(hào)：EKY0323H）標(biāo)記-堿性磷酸酶稀釋物，用量50ul/測試；

試劑3：TT3解離劑（發(fā)光專用）（貨號(hào)：DCH0208A）。

反應(yīng)條件：

第一步：10ul樣本+50ul試劑1+50ul試劑3混合，37℃孵育10min，清洗；

第二步：加入50ul 試劑2，37℃孵育10min，清洗；

第三步：加入底物，進(jìn)行測試。

4.2.2 FT3抗體配對(duì)組合2：

樣本:樣品加樣量20ul；

試劑1：T3抗體（貨號(hào)：EKY0323F）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；

試劑2：T3復(fù)合物抗體（貨號(hào)：EKY0323H）標(biāo)記-堿性磷酸酶稀釋物，用量50ul/測試；

試劑3：TT3解離劑（發(fā)光專用）（貨號(hào)：DCH0208A）。

反應(yīng)條件：

第一步：20ul樣本+50ul試劑1+50ul試劑2混合，37℃孵育10min，清洗；

第二步：加入底物，進(jìn)行測試。

測試使用發(fā)光儀器:迎凱Shine i2900。

4.3熒光免疫層析平臺(tái)

4.3.1 TT3抗體配對(duì)組合3

反應(yīng)條件：10ul樣品+100ul TT3解離劑（層析專用）（貨號(hào)：DCH0208B）混勻（無需等待解離），上樣，反應(yīng)時(shí)間（10min-15min）；

4.3.2 FT3抗體配對(duì)組合3

反應(yīng)條件：10ul樣品+100ul 稀釋液混勻，上樣，反應(yīng)時(shí)間（10min-15min）；

測試使用熒光儀器:和邁FIC-S100。

5.產(chǎn)品信息

產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	推薦配對(duì)
三碘甲狀腺原氨酸（T3）抗體	EKY0323F	TT3配對(duì)： T3抗體（貨號(hào)：EKY0323G）包被羧基磁珠+T3復(fù)合物抗體（貨號(hào)：EKY0323H）標(biāo)記吖啶酯+TT3解離劑（發(fā)光專用）（貨號(hào)：（貨號(hào)：DCH0208A））（發(fā)光配對(duì)組合1） T3抗體（貨號(hào)：EKY0323G）包被羧基磁珠+T3單抗3（貨號(hào)：EKY0323H）標(biāo)記堿性磷酸酶+TT3解離劑（發(fā)光專用）貨號(hào)：DCH0208A）（發(fā)光配對(duì)組合2） T3抗體（貨號(hào)：EKY0323G）標(biāo)記熒光微球+T3復(fù)合物抗體（貨號(hào)：EKY0323H）劃膜+TT3解離劑（層析專用）（熒光配對(duì)組合3） FT3配對(duì)： T3抗體（貨號(hào)：EKY0323F）包被羧基磁珠+T3復(fù)合物抗體（貨號(hào)：EKY0323H）標(biāo)記吖啶酯（發(fā)光配對(duì)組合1） T3抗體（貨號(hào)：EKY0323F）包被羧基磁珠+T3復(fù)合物抗體（貨號(hào)：EKY0323H）標(biāo)記堿性磷酸酶（發(fā)光配對(duì)組合2） T3抗體（貨號(hào)：EKY0323G）標(biāo)記熒光微球+T3復(fù)合物抗體（貨號(hào)：EKY0323H）劃膜（熒光配對(duì)組合3）
三碘甲狀腺原氨酸（T3）抗體	EKY0323G
三碘甲狀腺原氨酸（T3）復(fù)合物抗體	EKY0323H
三碘甲狀腺原氨酸（T3）校準(zhǔn)質(zhì)控物	DBY0185D
T3抗體（貨號(hào)：EKY0323F）包被羧基磁珠濃縮液	DKY1337A
T3抗體（貨號(hào)：EKY0323G）包被羧基磁珠濃縮液	DKY1337B
T3復(fù)合物抗體（貨號(hào)：EKY0323H）吖啶酯濃縮液	DKY1337C
T3復(fù)合物抗體（貨號(hào)：EKY0323H）標(biāo)記堿性磷酸酶濃縮液	DKY1337D
T3抗體（貨號(hào)：EKY0323G）標(biāo)記熒光微球濃縮液	DKY1337E
AMPPD 發(fā)光底物液（即用型）	DCD0517A
AMPPD 發(fā)光底物液（即用型）	DCD0517B
羧基磁性微球，1.5um	DEG0800C
時(shí)間分辨熒光微球，羧基（200nm）	AEG0786B
TT3解離劑（發(fā)光專用）	DCH0208A
TT3解離劑（層析專用）	DCH0208B
牛血清白蛋白(無蛋白酶,低脂肪酸,低lgG,內(nèi)毒素)	DCL0001T	磁珠濃縮液、吖啶酯濃縮液、堿性磷酸酶濃縮液的稀釋液中及包被及標(biāo)記種封閉劑含有此款BSA可有效降低背景信號(hào)值及提高信噪比。建議使用濃度1%-2%。
酶解深水魚皮明膠	ACH0085J	樣品墊、釋放墊、標(biāo)記過程中封閉劑或穩(wěn)定劑。建議使用濃度1%-10%。
蛋白保護(hù)劑GH	DCL0009A	推薦使用濃度20%左右。