單分子實(shí)時(shí)測序于海洋生物基因組學(xué)研究應(yīng)用

來源：生物谷作者：人氣：-發(fā)表時(shí)間：2014-12-05 09:15:00【大中小】

自從末端終止法測序技術(shù)發(fā)明以來，DNA測序技術(shù)在短短三十余年內(nèi)得到迅速發(fā)展，科學(xué)家們已經(jīng)向著人類千元（1000 美元）基因組時(shí)代發(fā)起沖擊。最初由于高昂測序成本的限制，全基因組測序涉及的領(lǐng)域受到限制，只有細(xì)菌等基因組很小的生物的全基因組被首先測定，線蟲、果蠅、擬南芥等模式生物的基因組隨后被測定，人類基因組計(jì)劃的實(shí)施推動(dòng)了基因組學(xué)在全世界的快速發(fā)展。這些測序工作都是采用Sanger法進(jìn)行，項(xiàng)目實(shí)施耗時(shí)費(fèi)力。隨著新一代測序技術(shù)（Next-generation sequencing, NGS）的出現(xiàn)，越來越多的物種啟動(dòng)了全基因組測序計(jì)劃。基因組研究機(jī)構(gòu)也呈現(xiàn)了多極化發(fā)展趨勢，中國成為國際基因組研究的重要一員。新一代測序技術(shù)基于新的測序原理，目前，單分子測測序方法日漸占據(jù)主導(dǎo)位置。

海洋生物是生物學(xué)研究的重要領(lǐng)域，美國自1997 年就開始計(jì)劃投資開展羅非魚、對(duì)蝦和牡蠣等海洋生物基因組研究。多個(gè)海洋藍(lán)藻基因組計(jì)劃也相繼啟動(dòng)[8]。隨著海膽基因組項(xiàng)目的完成，目前已有多個(gè)海洋生物基因組計(jì)劃啟動(dòng)或部分完成，中國已經(jīng)啟動(dòng)了扁藻、螺旋藻、牡蠣、對(duì)蝦等基因組計(jì)劃。一般而言，海洋生物基因組大、雜合度高、拼接難度大是研究海洋生物基因組的最大困擾。

由美國Pacbio公司開發(fā)研制的單分子實(shí)時(shí)測序該通過光學(xué)方法直接記錄單個(gè)聚合酶在不受干擾的情況下的連續(xù)合成，已經(jīng)使許多極富挑戰(zhàn)性的基因組學(xué)研究成為可能。這種以Pacbio技術(shù)為代表的模擬天然DNA復(fù)制過程的新型測序方法被稱為第三代測序技術(shù)。該技術(shù)不僅融合了天然DNA復(fù)制高效準(zhǔn)確的特點(diǎn)，而且是可以在不影響聚合酶活性的前提下實(shí)時(shí)觀測DNA合成，由于聚合酶的平均反應(yīng)速度可達(dá)1bp/s以上，因?yàn)槠錅y序速度比Sanger測序快了幾萬倍。目前已有科學(xué)家將單分子實(shí)時(shí)測序技術(shù)用于海洋生物研究：
例證：極地海洋微生物
韓國極地研究所的 Park博士一直致力于極地微生物研究，為了揭示從南極喬治王子島分離得到的Streptomyces菌株的基因組信息（7.6Mb），Park博士的研究團(tuán)隊(duì)首先利用illumina Hiseq 2000平臺(tái)對(duì)其基因組進(jìn)行測序。Streptomyces 的基因組中GC含量高達(dá)71%，即使利用Hiseq2000平臺(tái)進(jìn)行了200×深度的測序，仍無法獲得完整的基因組，組裝時(shí)產(chǎn)生了185 個(gè)contigs，隨后使用Sanger法仍然無法有效的填補(bǔ)gap。
Park博士表示，用其他的短序列測序技術(shù)仍然“不可能”填補(bǔ)這種高GC含量的基因組gap，所以他們轉(zhuǎn)而利用PacBio RS平臺(tái)對(duì)該基因組進(jìn)行驗(yàn)證。由于PacBio RS測序技術(shù)具有單分子分辨率，不引入PCR過程，沒有GC偏向性，研究人員利用該技術(shù)獲得了高準(zhǔn)確度的CCS數(shù)據(jù)和平均1.5kb的長片段進(jìn)行基因組組裝，僅僅對(duì)基因組覆蓋15×就能組裝得到26個(gè)contig（減少了86%），大大降低了基因組組裝的難度，而且gap也大為減小，使得他們首次獲得了該細(xì)菌的完整基因組信息。
Park博士和他的團(tuán)隊(duì)認(rèn)為PacBio的單分子實(shí)時(shí)測序技術(shù)“對(duì)高GC含量的基因組有著更好的測序能力，并且也是一項(xiàng)非常好的改善de novo測序和組裝的新工具”
Park博士受到該技術(shù)的鼓舞，決定繼續(xù)利用PacBio技術(shù)破解其他極地微生物基因組的組裝難題，挑戰(zhàn)此前“不可能完成的任務(wù)”。
極地微生物是一個(gè)特殊的群體，它們生存在正常生物無法生存的環(huán)境中，對(duì)這些微生物進(jìn)行研究能夠揭示諸如全球氣候變暖、生物進(jìn)化等方面的問題。此外，這些極地微生物有著迥異于正常環(huán)境微生物群體的代謝類型，能夠幫助人們尋找更加有效的抗生素，有助于發(fā)現(xiàn)新型的藥物應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
例證：北冰洋鱈魚
挪威Oslo大學(xué)生態(tài)和進(jìn)化合成中心（CEES）的科研人員用PacBio技術(shù)完成了北冰洋鱈魚基因組的拼接工作。北冰洋鱈魚是挪威和其他北歐漁業(yè)國家非常重要的經(jīng)濟(jì)物種，挪威政府一直以來不斷支持鱈魚基因組的測序工作，期望能從中找到關(guān)鍵基因，以提高鱈魚養(yǎng)殖業(yè)的抗病和高產(chǎn)能力。
鱈魚基因組（830 Mb）測序項(xiàng)目啟動(dòng)于2008年，由CEES的科學(xué)家牽頭，早期投入是在454平臺(tái)上用shotgun和mate-pair測序以及基于BAC的 Sanger測序法，但早期組裝結(jié)果非常不理想，Contig十萬個(gè)以上，Scaffold上千個(gè)，平均每個(gè)Scaffold中35%都是Gap，這給 Annotation帶來了極大挑戰(zhàn)，科研人員不得不從棘魚等其他魚類的基因信息中獲取參考，來重建鱈魚基因組中丟失的部分，才算發(fā)表出了史上第一個(gè)北冰洋鱈魚的基因組Draft。
CEES的科研工作者一直想找個(gè)法子優(yōu)化并升級(jí)Draft，尤其是當(dāng)他們對(duì)野生捕獲的鱈魚進(jìn)行基因組測序并遭遇到雜合性問題時(shí)。相比較之前的Draft，野生鱈魚的基因組中除了SNP不同之外，還出現(xiàn)了大量的幾百甚至幾千bp的插入和缺失，而且還有大量不同的STR，很難跟Draft進(jìn)行比對(duì)。如果不能拿到Finishing Genome，之前花大量時(shí)間和精力拿到的Draft就等于形同虛設(shè)了，于是他們被迫選擇了PacBio第三代測序。“當(dāng)我們把PacBio數(shù)據(jù)導(dǎo)入到之前的Draft中去后，大片段甚至是Kb以上級(jí)別的Gap就神奇地消失了，我們之前幾年的辛苦在這里瞬間完成了，我們遇到的STR和雜合性問題也迎刃而解了。我們之前從沒見過如此之快的組裝速度，全程才用了36小時(shí)。”參與項(xiàng)目的 Lex Nederbragt教授說道。目前他們正用PacBio數(shù)據(jù)逐步逐步修復(fù)之前靠棘魚等基因數(shù)據(jù)拼湊的組裝信息，然后全面展開鱈魚基因組比較研究和抗病基因篩選