您需要的大規模純化外泌體方法來了

來源：作者：人氣：-發表時間：2024-03-06 09:33:00【大中小】

外泌體的概念，研究熱度及應用領域在這里就不在贅述，感興趣的可以參考上一篇，初識外泌體。本文著重介紹一種基于PS層析捕獲法的大規模分離和純化高純度EV的技術。

眾所周知，由于外泌體在大小，組成和功能方面存在異質性，其分離和純化一直面臨著挑戰，加之外泌體的純化分離文獻方法眾多，國際上也沒有限定單一的分離手段，因此根據需求選擇合適的外泌體分離純化方案，對于外泌體研究至關重要！

本文介紹的新型PS層析方法支持規模放大的細胞培養上清中簡易分離和純化EV。

富士膠片和光采用與金澤大學醫學系免疫學的華山教授共同開發的分離和純化技術“PS親和法”^[1]，開發了用于大規模純化EV的MassivEV™ EV Purification Column PS（MassivEV™ 細胞外囊泡（EV）純化分離柱 PS）。配合使用專用的緩沖液MassivEV™ Purification Buffer Set（MassivEV™ 細胞外囊泡（EV）純化緩沖液套裝），可從支持規模放大的細胞培養上清中簡易分離和純化EV。

一純化原理

◆PS親和法利用與EV膜表面的磷酯酰絲氨酸（PS）特異性結合Tim4（(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4)）的性質。在鈣離子存在下，固定在載體上的Tim4可捕獲樣品中的EV。通過清洗去除雜質后，加入EV Elution Buffer（螯合劑），低損傷狀態下從載體上的Tim4的洗脫和純化EV的方法(富士膠片和光開發的EV分離方法)，該方法可使EV在完整狀態下高純度分離。

圖1. MassivEV™ EV Purification Column PS（PS親和法）分離和純化細胞外囊泡的原理

二產品概要

產品組成：MassivEV™ 細胞外囊泡（EV）純化分離柱 PS

產品組成：MassivEV™ 細胞外囊泡（EV）純化緩沖液套裝

MassivEV™ 細胞外囊泡（EV）純化分離柱 PS

MassivEV™ 細胞外囊泡（EV）純化緩沖液套裝

三產品優勢

使用方便，純度高，形態完整，耗時短，無儀器需求
可從大規格（10 mL至1L級別規格）細胞培養上清中高效分離和純化高純度EV
只需一個蠕動泵無需切向流過濾（TFF）系統等昂貴設備
高性價比（處理同一樣品時，可重復使用分離柱5次）

四操作流程

五應用對比

表1 從200 mL間充質干細胞培養上清中分離和純化EV的對比（富士膠片和光評估）

	MassivEV™	TFF+AEX*	TFF+SEC*
可純化的EV	PS陽性EV	取決于樣品	取決于樣品
純度	高	低	低
純化步驟數	1個步驟 - PS親和法	2個步驟 -TFF系統 -陰離子交換色譜法	2個步驟 -TFF系統尺寸排阻色譜法
EV粒子產量（參考值）	1.7x10¹¹ particles	1.1x10¹¹particles	0.7x10¹¹particles
純化所需時間	8 h	10 h	10 h

* AEX：陰離子交換色譜法；*SEC：尺寸排阻色譜法

參考：一只小鼠的EV建議給藥量^[²^-⁴^]）：1.0×10⁹particles/mouse

六性能數據

6.1 處理樣品量

	1mL	5mL
產品編號	131-19491	137-19493
樣品量*¹	200mL	1L
動態結合能力*²	5×10¹¹particles/mL 樹脂	2.5×10¹²particles/5 mL樹脂

*1 MSC細胞培養上清中一次純化可處理的大概樣品量。樣品處理量因細胞培養上清中所含的EV粒子數而異。處理同一樣品時，可重復使用分離柱，已確認最多可使用五次（初次使用1次、重復使用4次）。

*2 使用MSC來源EV的研究結果。可能因細胞種類等條件而異。

6.2 與傳統方法對比

在增殖培養基（MS Culture™/ 10% FBS)及EV生產培養基（EV-Up™）中培養骨髓來源的MSC，回收細胞培養上清后，使用0.22 μm過濾器過濾。取200 mL經過濾處理的細胞培養上清用作樣品，采用以下4種方法進行分離和純化。純化后的EV溶液分別使用Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)和ELISA進行分析。

分離方法

MassivEV™：MassivEV™ EV Purification Column PS / MassivEV™ Purification Buffer Set (本產品, PS親和法)

TFF：僅切向流過濾（500 kDa）

TFF+AEX：切向流過濾（500 kDa）＋陰離子交換色譜法

TFF+SEC：切向流過濾（500 kDa）＋尺寸排阻色譜法

（1）使用NTA 進行粒子分析

【結果】

與TFF相比，MassivEV™ 純化得到的粒子數量少，但與 TFF+AEX 或 TFF+SEC 相比，MassivEV™ 純化得到的粒子數量更多

（2）使用CD63 ELISA和CD81 ELISA的EV回收率比較（n=3）

【結果】

相比傳統方法，使用MassivEV™的EV回收率更高。

參考文獻

1. Nakai, W.et al.:Sci. Rep.6(1), 1(2016).

2. Mansouri, N.et al.:JCI insight,4(21), e128060(2019).

3. Angioni, R.et al.:Int. J. Mol. Sci.,21(22), 8874(2020).

4. Perets, N.et al.:Mol. Autism,11(1), 65(2020).

產品列表

適用于10 mL至1L級細胞培養上清

產品編號	產品名稱	產品規格	產品應用
131-19491	MassivEV™ EV Purification Column PS MassivEV™細胞外囊泡（EV）純化分離柱PS	1mL	基因研究
137-19493		5mL	基因研究
295-96601	MassivEV™ Purification Buffer Set MassivEV™細胞外囊泡（EV）純化緩沖液套裝	1mL×10次用 (5mL×2次用)	基因研究

以上MassivEV™ EV Purification Column PS、MassivEV™ Purification Buffer Set請配合一同使用

相關產品

適用于從10 mL以下的細胞培養上清和體液樣品中分離和純化EV

產品編號	產品名稱	產品規格	產品應用
294-84101	MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2 MagCapture™外泌體提取試劑盒PS Ver.2	2 tests	基因研究
290-84103		10 tests	基因研究

外泌體ELISA檢測

產品編號	產品名稱	產品規格	產品應用
298-80601	PS Capture™ Exosome ELISA Kit （Streptavidin HRP） PS Capture™ 外泌體ELISA試劑盒（鏈霉親和素HRP）	96T	基因研究

間充質干細胞（MSC）增殖用培養基

產品編號	產品名稱	產品規格	產品應用
132-19345	MSCulture™High Growth Basal Medium MSCulture™ High Growth基礎培養基	500 mL	細胞培養
133-19331	MSCulture™ High Growth Supplement MSCulture™High Growth添加劑	5 mL	細胞培養

以上MSCulture™ High Growth基礎培養基、MSCulture™ High Growth添加劑請配合一同使用

間充質干細胞（MSC）EV生產用培養基

產品編號	產品名稱	產品規格	產品應用
053-09451	Up™ EV Production Basal Medium for MSC, AF EV-Up™間充質干細胞外泌體生產用基礎培養基，無動物源成分	95mL	細胞培養
298-84001	EV-Up™MSC EV Production Supplement, AF EV-Up™間充質干細胞外泌體生產用添加劑，無動物源成分	5mL（100mL用）	細胞培養

以上EV-Up™基礎培養基、EV-Up™添加劑請配合一同使用

※ 僅供實驗研究用，不可用于臨床診斷。

答疑解惑

Q：Massiv^EV純化分離柱緩沖液套裝適合純化哪些細胞外囊泡？

A：可提取脂質膜表面暴露出磷脂酰絲氨酸（PS）的外泌體和微囊泡。

Q：是不是所有的外泌體都會暴露磷脂酰絲氨酸（PS）呢？

A：迄今為止所發現的外泌體，并非所有的外膜表面都暴露PS。例如，細菌來源的外泌體膜表面沒有PS，因此，本款試劑不能提取這種外泌體。

現在的研究尚未得知是否所有的外泌體上都會露出PS，但是上述的外泌體標記根據細胞種類不同表現出的信號強弱差大，通過利用PS親和法捕捉、提取外泌體是較好的方法。

Q：我們實驗室最近經費有限呢，Massiv^E^V 純化分離柱可以循環利用嗎？

A：使用MSC來源EV的研究結果表明：處理同一樣品時，可重復使用分離柱，已確認最多可使用五次（初次使用1次、重復使用4次）。

Q：用該試劑盒提取出來的囊泡怎么判斷是外泌體呢？

A：可以用和表面抗原對應的抗體進行免疫印跡（WB）、透射電子顯微鏡（TEM）、納米粒徑分析（如NanoSight LM10）等來驗證。ISEV建議用表面蛋白CD63等來界定所提取的細胞外囊泡，可使用Wako的PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Streptavidin HRP)（產品編號298-80601，見上產品列表），既能鑒定外泌體的CD63信號，又能進行定量、定性分析，一舉兩得！