免疫比濁項目解決方案
產品編號： 發表日期：2015-02-12 14:31:00
膠乳顆粒增強比濁法是近年來出現的一種較為穩定、準確的體液蛋白均相免疫比濁檢測方法。
咨詢電話：
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膠乳顆粒增強比濁法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA ）是近年來出現的一種較為穩定、準確的體液蛋白均相免疫比濁檢測方法。相對于Elisa方法，省去了孵育和洗板的步驟，幾分鐘就能獲得結果；相對于金標法具有更高的靈敏度，可用于定量檢測。
優點
（1）操作簡單，可在幾分鐘內快速、準確地檢測含量，真實反映病情進展和評估治療效果，對于疾病的早期診斷和治療具有重要的臨床意義；
（2）不易受人為操作和外界因素干擾，檢測穩定性和重復性都很好；
（3）能利用普通的生化分析儀進行檢測，容易實現自動化，可在各級基層醫療機構普及和應用。
（2）不易受人為操作和外界因素干擾，檢測穩定性和重復性都很好；
（3）能利用普通的生化分析儀進行檢測，容易實現自動化，可在各級基層醫療機構普及和應用。
影響共價偶聯的因素
A 活性基團和偶聯試劑
1、配體 因為活性和結合動力學是高度依賴于固定化分子的取向，故可用于偶聯和修飾的活性基團必須慎重考慮。
2、微球 生物分子可通過各種表面化學試劑偶聯到聚合物或硅基微球上。可用的表面官能團包括：聚合-羧基和氨基（常用的）以及羥基、肼基和氯甲基；和硅-醇硅基、羧基。
部分產品列表
(更多產品請見http://www.seebio.cn/Article/1404_1.html)
3、交聯劑 交聯劑可用于激活含水環境中表現出低反應活性的基團（碳二亞胺與羧基結合），或者加入到對彼此沒有反應的基團中（如氨基與氨基結合）
產品列表
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產品名稱
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固含量
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2.5% ~ 5% w/v
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5% w/v
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2.5% ~ 5% w/v
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粒徑
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0.2-8um
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0.7-0.9um
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0.05-8um
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規格
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10ml, 100ml
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10ml, 100ml
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10ml, 100ml
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3、交聯劑 交聯劑可用于激活含水環境中表現出低反應活性的基團（碳二亞胺與羧基結合），或者加入到對彼此沒有反應的基團中（如氨基與氨基結合）
產品列表
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英文品名
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中文品名
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CAS
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規格
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EDC
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25952-53-8
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5g, 25 g
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NHS
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6066-82-6
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100g
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Sulfo-NHS
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106627-54-7
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10g, 50g
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SMCC
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64987-85-5
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50mg
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|
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Sulfo-SMCC
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92921-24-9
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50mg, 1g
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B 微球組成
微球的特定組成將決定其特性，如如疏水性或親水性，正電荷或負電荷，表面電荷密度等，這些特點都會對其承載能力有一定影響。也就是說，生物分子怎么有效地進入化學基團附近，以便可能發生偶聯。他們還將影響非特異性結合特性，但非特異性結合可能與阻斷劑、緩沖液及檢測的條件（如：樣品稀釋）等有關。
C 試劑的質量
試劑的質量對成功的偶聯是至關重要的，并影響包被微球的性能。遵從制造商的指引
用于試劑調制，使用，存儲，和過期應觀察到保證活性和穩定性，并且采取措施防止污染。
D、試劑的濃度
確定不同試劑的適當濃度，比如配體或交聯劑，對控制表面密度很重要。使用太少會導致包被不是較理想且活性低。使用太多會導致微球“過載”（空間位阻效應，減少活性）或者單純地浪費昂貴的試劑。
E、緩沖液
1、總論
緩沖液的選擇和具體方案（配體和反應基團）有關。在選擇緩沖液時，考慮到與配體的相容性。此外，還要考慮到緩沖液中不能包含參與或干擾反應的化合物。比如，磷酸鹽和醋酸鹽緩沖液會降低碳二亞胺的反應活性，因此不建議在羧基微球偶聯中作為激活緩沖液使用。在這種情況下，一種流行的替代是使用MES。又如，在與胺活性化學物質作用時，應避免含有游離胺的緩沖液（Tris或甘氨酸）。
2、配方中常用的緩沖液
a、磷酸鹽緩沖液（PBS）pH 7.4
i. 磷酸氫二鉀: 1.82 g/L (MW 174.2)
ii. 磷酸二氫鈉: 0.22 g/L (MW 120.0)
iii. 氯化鈉: 8.76 g/L (MW 58.4)
用去離子水最終定容至1L，用1N鹽酸或1N氫氧化鈉調節pH至7.4.
b、硼酸鹽緩沖液 pH8.5
i. 硼酸, H3BO3: 12.4 g/L (MW 61.8)
ii. 硼氫化鈉: 19.1 g/L (MW 381.4)
加入50mL硼酸溶液至14.5mL硼氫化鈉溶液中,用去離子水最終定容至200mL。用3M的氫氧化鈉 調節pH至8.5.
c、醋酸鹽緩沖液 pH3.6~5.6
i. 0.1 M 醋酸: (5.8mL制備1000mL)
ii. 0.1 M 醋酸鈉: 8.2 g/L (無水, MW 82.0)
按如下所示比例混合醋酸和醋酸鈉溶液，用去離子水最終定容至100mL。用1N鹽酸或 1N氫氧化鈉調節pH。
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醋酸/mL
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46.3
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41.0
|
30.5
|
20.0
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14.8
|
10.5
|
4.8
|
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醋酸鈉/mL
|
3.7
|
9.0
|
19.5
|
30.0
|
35.2
|
39.5
|
45.2
|
|
pH
|
3.6
|
4.0
|
4.4
|
4.8
|
5.0
|
5.2
|
5.6
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d、檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液 pH2.6~7.0
i. 0.1 M 檸檬酸: 19.2 g/L (MW 192.1)
ii. 0.2 M 磷酸氫二鈉: 35.6 g/L (二水, MW 178.0)
按如下所示比例混合檸檬酸和磷酸氫二鈉溶液，用去離子水最終定容至100mL。用1N 鹽酸或1N氫氧化鈉調節pH。
按如下所示比例混合檸檬酸和磷酸氫二鈉溶液，用去離子水最終定容至100mL。用1N 鹽酸或1N氫氧化鈉調節pH。
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檸檬酸/mL
|
44.6
|
35.9
|
29.4
|
24.3
|
19.7
|
13.6
|
6.5
|
|
磷酸氫二鈉/mL
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5.4
|
14.1
|
20.6
|
25.7
|
30.3
|
36.4
|
43.6
|
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pH
|
2.6
|
3.4
|
4.2
|
5.0
|
5.8
|
6.6
|
7.0
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e、碳酸鹽-碳酸氫鈉緩沖液 pH9.2-10.4
i. 0.1 M 碳酸鈉: 10.6 g/L (無水, MW 106.0)
ii. 0.1 M 碳酸氫鈉: 8.4 g/L (MW 84.0)
按如下所示比例混合碳酸鈉和碳酸氫鈉溶液，用去離子水最終定容至200mL。用1N 鹽酸或1N氫氧化鈉調節pH。
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碳酸鈉/mL
|
4.0
|
9.5
|
16.0
|
22.0
|
27.5
|
33.0
|
38.5
|
|
碳酸氫鈉/mL
|
46.0
|
40.5
|
34.0
|
28.0
|
22.5
|
17.0
|
11.5
|
|
pH
|
9.2
|
9.4
|
9.6
|
9.8
|
10.0
|
10.2
|
10.4
|
f、MES緩沖液 pH5.7~7.2
溶解21.3gMES一水物至約900mL的純水中。用1N鹽酸或1N氫氧化鈉滴定至所需的pH并用純水定容至1000mL。
產品列表
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貨號
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英文品名
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中文品名
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CAS
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規格
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Dipotassium hydrogenphosphate
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7758-11-4
|
500g
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Sodium phosphate monobasic dihydrate
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13472-35-0
|
500g
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|
Sodium chloride
|
7647-14-5
|
500g
|
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|
Boric acid
|
10043-35-3
|
500g
|
||
|
Sodium acetate
|
127-09-3
|
500g
|
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|
Citric acid anhydrous
|
77-92-9
|
500g
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||
|
Sodium phosphate dibasic dihydrate
|
10028-24-7
|
500g
|
||
|
Sodium carbonate, anhydrous
|
497-19-8
|
500g
|
||
|
Sodium hydrogen carbonate
|
144-55-8
|
500g
|
||
|
MES monohydrate
|
145224-94-8
|
500g
|
||
|
MOPSO
|
68399-77-9
|
1Kg
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||
|
HEPES
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7365-45-9
|
1Kg
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*膠乳溶液一般常用低濃度的Good's緩沖液儲存。（更多Good's緩沖液請見http://www.seebio.cn/Article/goods%20buffer_1.html）
3、抗菌劑
低濃度(0.05%-0.1%)的抗菌劑,例如疊氮鈉或硫柳汞，經常被加入到儲存緩沖液中，特別是長期儲存的時候。抗菌劑的選擇要謹慎，因為他們可能會展現出不同的穩定性，涉及到特殊處理事項等。例如，疊氮鈉與鉛、銅管道反應會生成易爆的疊氮金屬化合物，因此，在清理材料時，要用大量的水沖洗管道并防止疊氮化物積累。
F、阻斷劑
阻斷劑通常在偶聯反應后用于包被微球，可以使微球與非目標分子的非特異性結合最小化。阻斷劑應謹慎選擇，以確保它可以有效地減少非特異性相互作用。某些阻斷劑可能會干擾檢測，或實際上有助于非特異性結合。對阻斷劑的濃度進行評估，確保有足夠的阻擋而沒有明顯的活性損失。阻斷劑通常以不同的量加入到儲存緩沖液中，標準濃度為0.05~0.1%中的任意值。在一個獨立的孵育中，為了飽和微球的暴露表面，建議在儲存前用更高濃度的阻斷劑（1%）。以下是一些常用的阻斷劑：
a. BSA(牛血清白蛋白）：經常單獨使用，但是可以和其他的阻斷劑復合使用，常用的表面活性劑。
b. 酪蛋白：一種牛奶基質的蛋白質，含有生物素原，在工作系統涉及生物素時應避免使用以防止干擾。
c. Pepticase（酪蛋白酶解產物）：酪蛋白的酶促衍生物，當工作系統涉及生物素時同樣應該避免。
d. 非離子表面活性劑：吐溫20和Triton™X-100是典型的。當與另一種阻斷劑使用時，一個常用的比例為1％阻滯劑; 0.05％的表面活性劑。
e. 不相關的“IgG”：經常在標記特性IgG到微球上時使用。例如：如果偶聯小鼠IgG，兔（或任何非交聯反應的IgG）可以用作阻斷劑被吸附。
f. FSG（魚皮明膠）：純明膠或明膠水解產物也可使用。
g. PEG（聚乙二醇）：多功能的阻斷劑，可提供不同的分子量、結構和負載。
h. 血清：非交聯反應血清，如馬血清或魚血清，在與各類抗體的交聯反應中都有很強的惰性。
i. 商業阻滯劑：許多公司提供制劑，其是各種分子量的兩種或更多種單阻斷物質的復合，并且其可以有效地在寬范圍的條件下使用。這些以不同的商品名稱出售，而大多數化學廠商將提供多種。
阻斷劑的品種還有許多，我們建議嘗試各種組合和濃度。
產品列表
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貨號
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英文品名
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中文品名
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CAS
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規格
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BSA
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9048-46-8
|
500g
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Casein From Bovine Milk Sodium
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9005-46-3
|
1Kg
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|
Pepticase
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|
250g, 5Kg
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|
Tween 20
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9005-64-5
|
5L
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Triton X-100
|
9002-93-1
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500mL, 5L
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Gelatin from fish skin
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9000-70-8
|
100g
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G、微球的處理
微球的處理對偶聯過程的結果有著顯著的影響。研究人員應該先考慮微球的清洗過程，這會影響偶聯的效率，微球的損失等。在過程控制中應當對其的單分散性進行監控，如果觀察到凝集則需要處理。
H、其他
還有其他參數可以被評估，包括培養時間和溫度，試劑添加的順序和速度等。
膠乳微球使用中常見問題及解答
問題：如何選擇微球粒徑？
回答：一般選擇粒徑小的膠乳微球，則需要的抗體量就多，精密度和線性相對較好，而選擇粒徑大的膠乳微球性，則所需抗體少，精密度和線性相對較差，相對于小球，大球的靈敏度較好。
問題：膠乳的自凝現象如何控制和避免？
回答：膠乳自凝與許多因素有關，如高電解質濃度、表面價電荷被中和、或置于某些不利環境如冷凍時。如果電解質濃度升高到某一水平，使得表面的價負荷被掩蔽，膠乳微球之間發生接觸，于是便產生凝集，故高離子強度的緩沖溶液不應使用，緩沖溶液的的濃度不要超過 50mM，但有些 CML 膠乳微球具有高電荷密度，則也能夠耐受較高的離子強度。對負電荷膠乳微球，不能使用陽電荷的緩沖溶液如 Tris 緩沖溶液，因為能使電荷中和而凝集。在長期貯藏時，懸浮介質的pH值應至少保持在比膠乳微球表面基團的 pKa 值高1-2pH單位。高濃度的膠乳微球容易促使膠體不穩定，故膠乳微球的濃度盡量以低濃度為宜，膠乳微球也不能受冷凍，否則會凝集。
問題：微球與抗體偶聯應選用一步法還是二步法？
回答：一步法是將微球、抗體、偶聯劑一起加入到體系中進行反應，更適用于小分子的偶聯，比如：類固醇、半抗原。
問題：微球與抗體偶聯后，當時沒發現有凝集，但隔夜后發現有凝集，這是什么原因？ 如何控制和避免？
回答：這種情況一般是偶聯效率低的原因。當體系中蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交聯后還空出許多反應基團時，這些基團又可以與相連微球上的蛋白反應，結果是把球又拉在一起了，所以有聚集。可以加一些阻斷劑解決。
問題：膠乳溶液用什么緩沖液多大離子強度保存穩定性較好？
回答：一般常用的是低濃度的 Goods 緩沖液，如MOPSO、MES、HEPES 等緩沖液，濃度在25-50mmol/L。
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研發生產中心：上海市浦東新區川宏路508號5幢 郵編：201202
