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可用于活細胞的GST活性檢測探針 DNs-Rh

來源：作者：人氣：-發表時間：2023-10-16 08:47:00【大中小】

可用于活細胞的GST活性檢測探針

DNs-Rh ＜Cell-based GST Activity Assay Reagent＞

DNs-Rh是可以在活細胞中觀察Glutathione S-transferase（GST）酶活性的熒光探針。由于可以根據GST活性發出綠色熒光，可用于評價細胞內GST的活性。GST亞家族跨度廣泛，可以實現總GST活性的可視化。

※本產品基于名古屋大學理學研究科阿部洋教授的研究成果商品化。

※本產品僅供科研，嚴禁用于科研以外用途。

DNs-Rh具有細胞膜透過性，隨著細胞內GST酶活性改變而產生綠色熒光。通過顯微鏡或流式細胞儀定量熒光強度，從而實現GST活性的相對定量。

◆GST及其活性檢測方法

Gluthathione S-Transferase（GST）家族廣泛存在于細菌及動植物中，細胞內的疏水性外源物質（xenobiotics）被添加到gluthathione（GSH）中，具有轉換為GSH綴合物（GSH-conjugate）的活性。GSH綴合物通過MRP（multidrug resistance-associated protein）運輸積極地排出細胞外，存在去除異物的機制。因此，GST可以作為排出具有潛在細胞毒性的外源性物質的解毒因子而發揮作用。

另一方面，由于大多數的抗癌劑等醫藥品也是通過GST轉換為GSH綴合物排出細胞外，GST作為耐藥因子具有削弱藥效的負面效果。尤其是隨著癌癥的惡化特定的GST同種型（GSTP₁）的表達量增強，癌細胞獲得了強耐藥性。

GST既是異物代謝和解毒作用因子，也具有耐藥性因子的作用。因此，需要合適的檢測細胞內GST活性的技術，但傳統方法僅限于in vitro 的活性檢測，缺少在活細胞內觀察活性的方法。

名古屋大學阿部洋教授及其研究人員們開發的DNs-Rh是細胞膜透過性的化合物，是一種可以根據GST酶活性產生綠色熒光的GST活性應答探針。因為可以用于活細胞，進行各類細胞的GST活性的定量化和刺激依賴性的GST活性的監測，可以用于傳統方法無法實現的基于細胞水平的抑制劑的開發等的各種應用。

GST作用示意圖

>GST活性檢測用探針的比較

>探針名稱			傳統方法（CDNB）	DNs-Rh
>檢測方法			UV（~340 nm）	綠色熒光（Ex / Em = 496 / 520 nm）
>檢測對象			廣泛的GST家族	廣泛的GST家族
>適用實驗	in vitro（如裂解液或純化酶）		可以	可以
	>活細胞實驗	>成像	不可以	可以
		>流式細胞術	不可以	可以
>檢測靈敏度			低（UV測定）	高（熒光測定）
>高通量和簡便性			低（需要配制裂解液）	高（活細胞狀態下觀察）
>非特異性反應（GST非依賴的GSH反應性）			高	低
>與其他的因子同時檢測			不可以	可以（可以和藍色和紅色熒光同時使用）

◆詳細原理

DNs-Rh是在Rhodamine110上添加2個GST基質2,4- dinitrobenzene sulfonamide（DNB）的化合物，呈消光狀態。DNB基質通過GST轉換為GSH綴合體，Rhodamine 110釋放出來并發出綠色熒光（激發／熒光 = 496 / 520 nm）。DNs-Rh最初開發作為檢測體內硫醇的試劑^1），但后來卻被發現其也能高效用作GST活性的檢測試劑^2）。與硫醇應答相比，GST應答性更強，現在我們期待DNs-Rh能成為活細胞用的GST活性檢測探針^4）。

原理示意圖

◆參考文獻

1. Shibata, A.,et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 18, 2246-2249 (2008) [PMID:18358719] "Rhodamine-based fluorogenic probe for imaging biological thiol."

2.Alander, J., et al., Anal. Biochem., 390, 52-56 (2009) [PMID:19348782] "Characterization of a new fluorogenic substrate for microsomal glutathione transferase 1."

3.Zhang, J.,et al., J. Am. Chem. Soc., 133, 14109-14119 (2011) [PMID:21786801] "Synthesis and characterization of a series of highly fluorogenic substrates for glutathione transferases, a general stategy."

4.Shishido, Y., et al.,ChemBioChem., (in press) "A covalent inhibitor for Glutathione S-Transferase Pi (GSTP1-1) in human cells."

◆特點

●　根據GST活性釋放rhodamine110產生綠色熒光（激發/熒光=496/520 nm）。

●　具有細胞膜通透性，只需添加至培養基即可使用。

●　已確認與各種GST家族具有交叉反應性

◆應用實例

>熒光光譜（反應前后）

向GSTP₁重組體（10 μg/mL）中添加DNs-Rh（1 μM）、GSH（1 mM）30分鐘后，測定激發光為490 nm時的熒光光譜。僅在GSH / GSTP₁存在時觀察到了Em_max520 nm附近的熒光。

熒光光譜

GST in vitro活性檢測

向GSTP₁重組體（10 μg/mL）中添加DNs-Rh（1 μM）、GSH（1 mM）觀察綠色熒光強度（Ex / Em 490 / 520 nm）隨時間的變化，縱軸將1 μM Rhodamine 110溶液的熒光強度設為100%。GST存在時，可以發現（GSH（＋）/ GST（＋））在約30分鐘左右的時候熒光強度明顯增強，約55%的探針轉換成Rhodamine，相對的，在GSH（＋）/ GST（?）的條件下，可以觀察到GSH稍微有所增加，但是Rhodamine的轉換率只有3%。

※ 正如原理所述，DNs-Rh與硫醇化合物反應甚微。與GST存在時相比反應明顯較弱，但是也有可能經過幾個小時的長時間反應使熒光強度增強，因此建議在反應30~60分

※ 鐘左右后即刻進行觀察。

>活細胞熒光測定

>培養細胞中的GST活性測定

向HeLa細胞中添加2.5 μM的DNs-Rh，孵育30分鐘后用熒光顯微鏡（Ex 480 / Em 535 nm）進行觀察。添加1 mM的不可逆性抑制物質CNBSF（#FDV-0031）作為前處理，反應15分鐘。通過DNs-Rh 從細胞內觀察到 Rhodamine 110 的綠色熒光，但是用抑制物質 CNBSF 進行前處理時，熒光強度明顯減弱。

※ 成像注意：本試劑是通過觀察GST釋放出來的rhodamine 110在細胞內的分布，雖然可以基于熒光強度觀察GST的相對活性強度，但不能實現細胞內GST定位的可視化。