檢測mPEG和mPEG化蛋白的ELISA試劑盒

應用： 此試劑盒只用于科研，不可用于診斷或治療

產品介紹：
治療蛋白通過結合mPEG鏈以PEG化，蛋白PEG化后可通過減緩蛋白水解和從循環系統中清除的速率來延長半衰期，因此可以增加其療效（refs.1&2）。mPEG化蛋白的藥效學通常情況下應用對多肽鏈的特異性分析進行評估。但這些方法需要消耗大量時間，且建立目標蛋白的ELISA昂貴。mPEG ELISA試劑盒可以檢測mPEG鏈，因此適合評估mPEG化生物制劑和mPEGs的藥效學。

分析試劑盒基于夾心ELISA原理，它應用了兩個抗-PEG小鼠單克隆抗體。針對PEG的聚乙二醇主鏈的特異性抗體包被在96孔板上，用于捕獲。另一專一性抗體用于特異性結合結合了辣根過氧化物酶的mPEG的末端甲氧基，進行檢測。

此ELISA試劑盒可用于檢測游離mPEG（圖1）和帶有一個或多個mPEG鏈的mPEG化蛋白（圖2）。然而，它不能檢測缺少末端甲氧基的PEG鏈。試劑盒的靈敏度隨著mPEG鏈的長度而變化，因此mPEG或mPEG化的分子應該產生一個標準曲線。研究表明此試劑盒可識別分子量大于等于2kDa的mPEG。試劑盒提供5kDa mPEG-氨的標準品，可方便用戶去檢測試劑盒的性能。

分析方法：
首先將100ul的HRP抗-mPEG加入到微孔板中，然后加入100ul的稀釋樣品和標準品，在微孔板振蕩器上混勻1小時。沖洗微孔以后，加入100ul的TMB到微孔中，孵育20分鐘，結果會產生藍色。加入1N HCL 100ul終止反應，藍色會變為黃色，檢測其在450nm處的吸光值。mPEG的濃度從標準曲線上獲得。

試劑盒包含以下內容：
抗-PEG包被的96孔板（12個可拆開的條，每條8孔），在-20℃下儲存
HRP 抗-mPEG復合物，25ul（1瓶）。在-20℃下儲存
mPEG稀釋液，50ml
5kDa mPEG-氨標準品，100ul（1瓶）。在-20℃下儲存           
mPEG清洗緩沖液，60ml
TMB試劑，11ml
終止液，11ml

需提供以下試劑或耗材：
移液器和槍頭
蒸餾水或去離子水
聚丙烯或玻璃管
漩渦混合器
微孔板振蕩儀（混合速度，150轉/分鐘）
平板墊圈
在450nm處光密度在0-4的平板閱讀器
繪圖軟件

標準液的制備：

 1、標記8支聚丙烯管或玻璃管，濃度為20,10,5,2.5,1.25,0.625，0.3125和0ng/ml

 2、制備20ng/ml的標準品，標記在5kDa mPEG標準品標簽上

 3、加入250ul的稀釋液到管中，標記為10,5,2.5,1.25,0.625,0.3125和0ng/ml

 4、吸取250ul的20ng/ml mPEG標準品到管子中，標記10ng/ml，并混合。此試劑盒提供10ng/ml PEG-BSA標準品。

 5、通過連續稀釋相同地制備5,2.5,1.25,0.625和0.3125ng/ml的標準品

分析過程：

 1、保護支持板上合適數量的包被孔

 2、加入100ul的HRP 抗-mPEG復合物到孔中

 3、吸取100ul標準品和樣品到孔中（建議標準品和樣品分別一式三份）

 4、在150轉每分鐘的微孔板振蕩器上室溫（25℃）孵育1小時

 5、使用一個平板墊圈，清洗孔6次，每孔加入400ul的清洗液

 6、吸取100ul的TMB試劑到每個孔中

 7、在150轉/分鐘的微孔板振蕩器上輕輕地混合20分鐘

 8、加入100ul的終止液到每個孔中終止反應

 9、輕輕混合直到藍色變為黃色

 10、5分鐘內讀取450nm處的吸收值

結果計算：

 1、讀取參考標準品和樣品在450nm處的平均吸光值

 2、用平均吸光值和濃度值做標準曲線，Y軸是吸光值，X軸是濃度

 3、用合適的模型和電腦繪圖軟件導入數據

 4、使用每個樣品的平均吸光值來確定mPEG或mPEG化蛋白的濃度值

 5、濃度乘以稀釋因子計算出血清或血漿樣品中mPEG化蛋白的實際濃度

 6、如果樣品的吸光度值不在標準曲線范圍，樣品需要重新稀釋和檢測

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