布魯頓酪氨酸激酶抑制使BCL10功能獲得突變體驅(qū)動(dòng)的多藥耐藥DLBCL腫瘤對(duì)venetoclax重新敏感

來(lái)源：作者：人氣：-發(fā)表時(shí)間：2025-02-05 16:17:00【大中小】

摘要：研究人員聚焦于彌漫大 B 細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）。

近期，來(lái)自美國(guó)邁阿密大學(xué)米勒醫(yī)學(xué)院（University of Miami Miller School of Medicine）的 Caroline A. Coughlin、Dhanvantri Chahar 等研究人員，在《Blood Cancer Journal》期刊上發(fā)表了題為 “Bruton’s tyrosine kinase inhibition re-sensitizes multidrug-resistant DLBCL tumors driven by BCL10 gain-of-function mutants to venetoclax” 的論文。這一研究聚焦于彌漫大 B 細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL），為攻克其治療難題提供了關(guān)鍵的理論依據(jù)和潛在的治療策略，對(duì)推動(dòng) DLBCL 的精準(zhǔn)治療具有重要意義。

圖1 布魯頓酪氨酸激酶抑制使BCL10功能獲得突變體驅(qū)動(dòng)的多藥耐藥DLBCL腫瘤對(duì)venetoclax重新敏感

一、研究背景

DLBCL 作為最常見(jiàn)的淋巴瘤類型，雖然一線聯(lián)合化療免疫療法對(duì)部分患者有效，但復(fù)發(fā)或難治性（rel/ref）患者的預(yù)后依舊很差。B 細(xì)胞受體（BCR）下游信號(hào)傳導(dǎo)在 DLBCL 進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，尤其是活化 B 細(xì)胞（ABC）起源的腫瘤，需要 CARD11 - BCL10 - MALT1（CBM）復(fù)合物激活 NF - κB。在 DLBCL 中，存在眾多導(dǎo)致 CBM 激活的基因組改變，然而，突變和信號(hào)傳導(dǎo)的異質(zhì)性阻礙了靶向信號(hào)抑制劑在 DLBCL 治療中的應(yīng)用。

近年來(lái)，BCL10 功能獲得性突變成為 DLBCL 中 CBM 激活的新驅(qū)動(dòng)因素，這類突變約在 5% 新診斷的 DLBCL 患者中出現(xiàn)，且在 ABC 富集的 LymphGen BN2/Chapuy C1 病例中聚集。BCL10 突變不僅介導(dǎo)對(duì)布魯頓酪氨酸激酶（BTK）抑制劑的耐藥，還使腫瘤對(duì)多種其他藥物產(chǎn)生抗性，因此，探索針對(duì) BCL10 突變驅(qū)動(dòng)的 DLBCL 的有效治療策略迫在眉睫。

二、研究材料與方法

（一）細(xì)胞系與試劑

研究中使用的細(xì)胞系源自 ATCC 和合作方，并經(jīng)過(guò)真實(shí)性驗(yàn)證。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用化合物來(lái)源詳見(jiàn)補(bǔ)充表 1。

（二）BCL10 突變體的克隆與過(guò)表達(dá)

運(yùn)用 QuikChange II XL 定點(diǎn)突變?cè)噭┖性?plvx Tetone 載體中構(gòu)建 BCL10 突變體，通過(guò)轉(zhuǎn)染 293 T 細(xì)胞產(chǎn)生病毒，依據(jù) GFP 表達(dá)測(cè)定感染效率，并用嘌呤霉素篩選。

（三）競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)

將含有空載體、BCL10 野生型和突變體的 plvx - IRES - ZsGreen1 載體感染細(xì)胞，使用 Attune 細(xì)胞儀檢測(cè) GFP。細(xì)胞經(jīng) BTK 抑制劑處理 72 - 96 小時(shí)后，洗去藥物使其恢復(fù)，重復(fù)該步驟兩次，每 48 小時(shí)檢測(cè)一次 GFP。

（四）細(xì)胞活力與協(xié)同作用檢測(cè)

在 96 孔板（每孔 5000 個(gè)細(xì)胞）或 384 孔板（每孔 1000 個(gè)細(xì)胞）中進(jìn)行系列藥物稀釋培養(yǎng)細(xì)胞，利用 Cell Titer Glo 檢測(cè)細(xì)胞活力，通過(guò) GraphPad Prism 進(jìn)行非線性擬合回歸分析得出，并在特定網(wǎng)站計(jì)算 Bliss 協(xié)同評(píng)分。

（五）雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

在 12 孔板中接種個(gè) 293 T 細(xì)胞，24 小時(shí)后用 Lipofectamine 轉(zhuǎn)染 50 ng NFκB、25 ng 海腎熒光素酶和 50 ng 目的質(zhì)粒，孵育 40 小時(shí)后使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。

（六）其他實(shí)驗(yàn)方法

研究還運(yùn)用了 EGFP NF - κB 報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）、磷酸激酶和細(xì)胞因子陣列、RNA 測(cè)序及分析、藥物篩選、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、線粒體膜電位檢測(cè)、定量實(shí)時(shí) PCR、組織學(xué)和免疫組化等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從不同層面探究 BCL10 突變?cè)?DLBCL 中的作用機(jī)制及相關(guān)治療策略的效果。

圖2 BCL10突變對(duì)基因表達(dá)的影響

三、研究結(jié)果

（一）BCL10 突變對(duì)基因表達(dá)的影響

研究人員在 ABC - DLBCL 細(xì)胞系中構(gòu)建了 BCL10 功能獲得性突變系統(tǒng)，通過(guò) RNA 測(cè)序發(fā)現(xiàn)，BCL10 突變體（S136X 和 R58Q）與空載體樣本相比，基因表達(dá)存在顯著差異。突變體激活了 NF - κB 信號(hào)通路，使 TNFα 產(chǎn)生增加，還影響了凋亡相關(guān)基因，包括 BCL2 家族成員的表達(dá)。同時(shí)，對(duì)未治療的 DLBCL 患者 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)的分析也證實(shí)，BCL10 突變病例中關(guān)鍵 TNFα 相關(guān)基因存在失調(diào)，這表明 BCL10 突變廣泛重塑了 DLBCL 的生物學(xué)特性。

（二）BCL10 突變促進(jìn)致癌細(xì)胞因子的產(chǎn)生

基因本體（GO）分析顯示，BCL10 突變體中細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)是上調(diào)最顯著的過(guò)程。在眾多細(xì)胞因子中，IL - 6、IL - 7、CCL22 等細(xì)胞因子在突變體中表達(dá)增加，且在 BCL10 突變患者的腫瘤中也顯著上調(diào)。ELISA 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了 TNFβ、IL - 6 等細(xì)胞因子的激活，這表明細(xì)胞因子產(chǎn)生是 BCL10 激活突變下游的淋巴瘤發(fā)生機(jī)制，對(duì)自分泌刺激和淋巴瘤微環(huán)境重編程具有重要意義。

（三）BCL10 突變使多種轉(zhuǎn)錄因子失調(diào)

對(duì) BCL10 突變體中上調(diào)基因的分析發(fā)現(xiàn)，有 16 種轉(zhuǎn)錄因子與之相關(guān)，包括 NF - κB（RELA 和 IRF4）、AP - 1（JUN 和 JUND）、ERK1/2 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子 CEBPB、ETS1、SPI1，以及由干擾素（STAT1、STAT2、PRDM1）和 IL7（EBF1、BCL11A）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子。患者數(shù)據(jù)和 Western blot 實(shí)驗(yàn)均驗(yàn)證了這些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn) IFNγ 信號(hào)通路相關(guān)的 CXCL10 產(chǎn)生增加，這表明 BCL10 突變通過(guò)激活多種轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)了基因表達(dá)的重編程。

（四）BCL10 突變阻礙多種藥物的療效

研究證實(shí) BCL10 突變會(huì)導(dǎo)致對(duì)共價(jià)和非共價(jià) BTK 抑制劑的抗性。通過(guò)對(duì) 960 種化合物的 TargetMol 表觀遺傳文庫(kù)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn) BCL10 突變體對(duì)多種藥物存在抗性，如 PI3K/AKT 抑制劑、BCL2 抑制劑維奈托克（venetoclax）、mTOR 抑制劑和 PIM 激酶抑制劑等，這些藥物在其他 B 細(xì)胞淋巴瘤治療中有效，但對(duì) BCL10 突變驅(qū)動(dòng)的 DLBCL 效果不佳，這表明 CBM 復(fù)合物的激活在臨床對(duì)特定藥物類別的抗性中起關(guān)鍵作用。

（五）BTK 抑制使 BCL10 突變腫瘤對(duì)維奈托克敏感

盡管 MALT1 蛋白酶抑制劑對(duì) BCL10 突變細(xì)胞有一定效果，但存在反饋激活 PI3K - AKT 信號(hào)通路等潛在混雜效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，維奈托克與 BTK 抑制劑或 PI3K 抑制劑聯(lián)合使用時(shí)，無(wú)論突變狀態(tài)如何，都呈現(xiàn)出相加或協(xié)同作用。其中，維奈托克與 pirtobrutinib 聯(lián)合使用在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出協(xié)同殺傷 BCL10 突變淋巴瘤細(xì)胞的效果，能使腫瘤完全消退，且未產(chǎn)生明顯毒性，這表明 BTK 在促進(jìn)藥物抗性中起關(guān)鍵作用，抑制 BTK 可與維奈托克協(xié)同克服這種抗性。

（六）維奈托克關(guān)鍵抗性因子的表達(dá)依賴于 BTK

BCL10 突變體中 BCL2 家族成員 BCL2L1、BCL2A1 和 BCL2 的表達(dá)顯著增加，這是對(duì)單藥維奈托克抗性的重要原因。而 pirtobrutinib 處理后，這些抗性因子的表達(dá)顯著下降，盡管 BCL10 突變細(xì)胞對(duì) pirtobrutinib 存在抗性，但這種處理降低了細(xì)胞的凋亡閾值。線粒體膜電位檢測(cè)和 Western blot 實(shí)驗(yàn)表明，維奈托克和 pirtobrutinib 聯(lián)合使用能有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這說(shuō)明即使 BCL10 突變激活 CBM 復(fù)合物導(dǎo)致對(duì) BTK 抑制劑抗性，BTK 仍對(duì)保護(hù)腫瘤細(xì)胞免于凋亡至關(guān)重要，抑制 BTK 可克服這種保護(hù)作用。

（七）BCL10 突變腫瘤中多個(gè)下游通路依賴于 BTK

在 BCL10 突變腫瘤中，IL6 - JAK - STAT3 等信號(hào)通路失調(diào)，STAT3 激活與抗凋亡基因上調(diào)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，IL6 的表達(dá)和產(chǎn)生、STAT3 的激活以及 PI3K/AKT 和 MAPK 通路的激活均對(duì) pirtobrutinib 敏感。通過(guò) CRISPR/Cas9 編輯構(gòu)建的內(nèi)源性 BCL10 單等位基因突變系統(tǒng)也證實(shí)，BTK 抑制劑與維奈托克聯(lián)合使用可克服 BTK 抗性，這表明盡管 BCL10 突變可導(dǎo)致 NF - κB 的 BTK 非依賴性激活和對(duì) BTK 抑制劑的抗性，但腫瘤細(xì)胞仍依賴 BTK 維持關(guān)鍵通路的激活。

四、研究結(jié)論與討論

該研究深入探討了 BCL10 突變?cè)?DLBCL 中的作用機(jī)制及潛在治療策略。研究結(jié)果驗(yàn)證并詳細(xì)闡述了 BCL10 突變導(dǎo)致 BTK 抑制劑抗性的現(xiàn)象，還發(fā)現(xiàn)這些突變使腫瘤對(duì)多種在 DLBCL 臨床試驗(yàn)中失敗的藥物產(chǎn)生抗性。通過(guò)細(xì)胞模型和臨床病例基因表達(dá)數(shù)據(jù)，揭示了細(xì)胞因子增強(qiáng)的正反饋環(huán)在 BCL10 突變背景下驅(qū)動(dòng)淋巴瘤發(fā)生的機(jī)制。

盡管之前研究發(fā)現(xiàn) BCL10 突變驅(qū)動(dòng)的腫瘤對(duì)破壞 MALT1 副胱天蛋白酶活性和抑制表觀遺傳擦除劑 LSD1 有一定敏感性，但單獨(dú)或聯(lián)合使用這些方法的效果并不理想。研究人員最終聚焦于聯(lián)合靶向 BTK 和 BCL2，發(fā)現(xiàn) BCL10 突變腫瘤雖對(duì)兩者單獨(dú)使用存在抗性，但它們的聯(lián)合使用卻能產(chǎn)生協(xié)同作用。非共價(jià) BTK 抑制劑 pirtobrutinib 可顯著降低 BCL2 家族成員的表達(dá)，影響線粒體相關(guān)蛋白，表明 BTK 在保護(hù)細(xì)胞免于凋亡中起關(guān)鍵作用，即使在 CBM 激活的情況下也是如此。

與此同時(shí)，臨床正在評(píng)估新型聯(lián)合方案 ViPOR，其包含維奈托克和 BTK 抑制劑（伊布替尼）等藥物，初步結(jié)果顯示在非 GCB 病例中活性較高，這或許能為該研究的機(jī)制提供臨床驗(yàn)證，但目前尚無(wú)法與 BCL10 功能獲得性突變這一特定生物標(biāo)志物直接關(guān)聯(lián)。

該研究也存在一定局限性，如未充分研究對(duì)淋巴瘤微環(huán)境的影響，僅探討了細(xì)胞因子的自分泌效應(yīng)，未來(lái)需要免疫活性模型來(lái)研究其旁分泌效應(yīng)。不過(guò)，總體而言，pirtobrutinib 聯(lián)合維奈托克的方案在 DLBCL 治療中展現(xiàn)出了潛力，值得進(jìn)一步評(píng)估其臨床實(shí)用性。這一聯(lián)合方案有望克服 DLBCL 的復(fù)雜性，為患者帶來(lái)新的希望，并且在免疫治療的背景下，如 CAR - T 細(xì)胞治療和免疫效應(yīng)器結(jié)合的多價(jià)抗體治療中，也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

參考資料

[1] Bruton’s tyrosine kinase inhibition re-sensitizes multidrug-resistant DLBCL tumors driven by BCL10 gain-of-function mutants to venetoclax