EVAGLAX(TM)細胞外囊泡分離純化試劑盒使用說明

來源：作者：人氣：-發(fā)表時間：2023-05-08 09:15:00【大中小】

EVAGLAX?細胞外囊泡分離純化試劑盒使用說明

EVAGLAX采用了孔徑精確可控、并帶有抗蛋白質非特異性吸附涂層的多孔玻璃作為過濾膜。無需使用超速離心機即可簡便快速地提取來自細胞外囊泡的RNA和蛋白質。同時，離心柱類型易于操作，簡化了實驗流程，有望減少操作的個體差異，確保實驗的重現(xiàn)性。

用途

用于早期診斷和治療選擇的細胞外囊泡衍生生物標志物提取
生物標志物研究、細胞外囊泡基礎研究
可用于體液（血清、血漿、尿液等）和細胞培養(yǎng)上清等

特征

孔徑精確可控的三維多孔玻璃技術
抗雜質蛋白質非特異性吸附的涂層技術
簡便快速地分離細胞外囊泡（15 分鐘）
基于尺寸排阻色譜法的原理，可以無偏差地捕獲細胞外囊泡

關鍵技術

多孔玻璃的孔徑精確可控，根據(jù)尺寸排阻色譜法的原理，可選擇性的捕捉細胞外囊泡大小的粒子。
濾膜表面涂有抗雜質蛋白質非特異性吸附的涂層，可抑制白蛋白等雜質蛋白的吸附。
通過與清洗液配合使用，可提高濾膜中捕獲的細胞外囊泡的純度。

操作流程

1.預處理
用?0.22 μm 針筒式過濾器預處理樣品。
2.細胞外囊泡捕獲
將樣品?(100-500uL) 注入離心柱中并離心?10 分鐘。
3.洗滌
將清洗液注入離心柱中并離心?5 分鐘。
4.提取
使用市售的提取試劑從離心柱中提取?RNA 和蛋白質進行分析。

產(chǎn)品組成

商品	20 次檢測	100次檢測
離心柱	20件	100件
收集管(1.5mL)	20件	100件
洗滌緩沖液A	10mL	50mL
洗滌緩沖液B	10mL	50mL

本試劑盒以外的、需要額外準備的耗材

類別	耗材種類	產(chǎn)品名	廠家	型號
通用	0.2μmPre-filter	Minisart Syringe Filter0.2μm	Sartorius	S6534FMOSK
通用	1mLSyringe	-	-	-
通用	1.5mL low protein adsorption tube	-	-	-
通用	2.0mL low protein adsorption tube	-	-	-
對于RNA	miRNeasy	miRNeasy Micro Kit	QIAGEN	217084
對于蛋白質	M-PER	Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Fisher Scientific	78501

保存條件

將試劑盒存放在2-10°C的冷藏環(huán)境中。

使用目的

本產(chǎn)品僅供研究使用。請不要將本產(chǎn)品用于人類或動物的醫(yī)學或臨床診斷。

細胞外囊泡分離步驟

【樣品制備過程】

如果標本已冷凍，請確保在4°C下解凍。
使用?0.2μm濾膜過濾樣品

*如果標本粘度高或者含有大量碎屑，建議先進行粗離心10,000G/30 min，然后用?0.2μm濾膜過濾上清液。?粗離心時，建議取上清后留150μL。

【細胞外囊泡捕獲過程】

將100-500μL樣品添加到離心柱中。
以6,000G離心10分鐘。（如果轉速不足，追加10,000G/3分鐘離心）

*如果擔心樣品堵塞，請將離心機的溫度設置為25°C。

丟棄含有流出液的外管，將內管插入一個新的1.5mL低蛋白吸附的收集管。

（*如果樣品中有雜質，可選擇追加以下操作：

①樣品中的雜質略高的情況

向離心柱中加入100μL洗滌緩沖液A，并以3,000G/5分鐘離心。
丟棄含有流出液的外管，將內管插入一個新的2mL低蛋白吸附的收集管。

②樣本中的雜質含量高的情況

將300μL洗滌緩沖液B放入離心柱并以3,000G/5分鐘離心。
丟棄含有流出液的外管，將內管插入一個新的2mL低蛋白吸附的收集管。

細胞外囊泡裂解步驟

【蛋白質提取工藝】

向離心柱中加入100uL M-PER ，并以500G/1分鐘離心。

*請勿丟棄流出液。使用2.0 mL低蛋白吸附的收集管，無需更換。

在室溫下保持5分鐘?。
以6,000G/5分鐘離心。（或者10,000G/3分鐘，視情況而定）
收集管中的液體即是樣品。

【RNA提取過程】

向離心柱中加入500uLQIAzol并以500G/1分鐘離心。

*請勿丟棄流出液。使用2.0mL低蛋白吸附的收集管，無需更換。

在室溫下放置5分鐘。
以6,000G/5分鐘離心。（或者10,000G/3分鐘，視情況而定）
將離心得到的液體轉移到新的1.5mL低蛋白吸附管中。不需要離心柱。
加入140uL氯仿，渦旋攪拌15秒，室溫放置3分鐘。
在4°C下以12,000G離心15分鐘，樣品分成3層。頂部透明層是含有RNA的水層，請吸出280μL透明層，注意避免混入下面的白色和紅色層，然后轉移到另一個1.5mL管中。
添加1.5體積的100%EtOH（即420uL），并通過移液器攪拌。

-----以下是?mirNeasy 的操作步驟-----

將700uL（盡可能多）樣品轉移到RNeasyMinElute離心柱中，輕輕蓋上蓋子，然后在8,000G下離心15秒。丟棄流出液。

（*如果需要用于NGS，此時需進行DNase處理。使用RNase-FreeDNaseSet(QIAGEN)。添加350uL?Buffer?RWT⇒8,000G，15分鐘
⇒加入DNase反應10分鐘
⇒添加350uL?Buffer?RWT⇒8,000G，15分鐘
請注意，如果實施此操作，則無需使用700uL?Buffer?RWT進行后續(xù)的清洗。)

向離心柱中加入700uL?Buffer?RWT，輕輕蓋上蓋子，8,000G離心15秒。丟棄流出液。
向離心柱中加入500uL?Buffer?RPE，輕輕蓋上蓋子，8,000G離心15秒。丟棄流出液。
向離心柱中加入500uL?80%EtOH，慢慢蓋上蓋子，8,000G離心2分鐘。連同流出液一起將收集管丟棄。
將RNeasy?MinElute離心柱放入新的收集管（2mL）。
以最大速度(>12,000G)離心5分鐘，同時打開柱蓋使其干燥。
將RNeasy?MinElute離心柱放入新的收集管（1.5mL）。向離心柱中加入14uL無RNase水（小容器）（注意不要粘在壁上！避免移液器吸頭接觸到濾膜！），慢慢蓋上蓋子，以最大速度(>12,000G)離心1分鐘提取RNA。

（*流出液即為樣品）

結果示例

EVAGLAX配合清洗液A使用

可得到與超速離心法同等的CD9強度和蛋白質純度。※