蛋白質的N-H鍵活化？

來源：作者：人氣：-發表時間：2016-07-19 10:05:00【大中小】

多肽的化學修飾對于藥物研發、生物材料以及生物分子探針的設計意義重大。但是，大部分針對多肽或者蛋白質的結構修飾都局限于支鏈的改造。我們知道，自然界經過億萬年的進化，能夠神奇精準的對蛋白質或者肽鏈的某一特定位置進行修飾（如乙酰化、甲基化等），這種看似簡單的操作對于生存卻意義重大，這種微小的結構變化對于穩定蛋白質的三維結構以及通過選擇性識別蛋白-蛋白相互作用來抑制某些酶的活性。比如細菌通過N-甲基化調控自身產生抗生素，生物體內組蛋白的乙酰化水平與腫瘤的產生息息相關。

目前多肽中氨基的烷基化或者芳基化仍存在很大挑戰。盡管可以用非自然的氨酰-tRNA合成酶來實現非自然肽鏈的合成，但使用N-取代的非天然氨基酸的報道非常有限。固相合成是另一種很好的取代方法，但是一旦涉及到N-烷基取代的氨基酸，往往兼容性就出現問題。而關于肽鏈骨架氨基的直接修飾方法就更少了。基于此，美國萊斯大學的Zachary Ball課題組開發了二價銅催化的肽鏈骨架N-H鍵活化（組氨酸定位基團）。（Histidine-Directed Arylation/Alkenylation of Backbone N–H Bonds Mediated by Copper(II).?J. Am. Chem. Soc.,?2016,?138, 7472-7475, DOI: 10.1021/jacs.6b03390）

Zachary Ball課題組開發了二價銅催化的肽鏈骨架N-H鍵活化

首先，作者用短鏈蛋白質促甲狀腺激素釋放激素（TRH，下圖中1）作為模型，在NMM緩沖液中，芳基硼酸化合物2在醋酸銅催化下與1發生N-芳基化得到化合物3。質譜、核磁二維譜及二級質譜確定修飾位點在組氨酸鄰位焦谷氨酸N上（此反應與Chan?Lam偶聯反應類似，但后者需要堿性條件且一般在無水環境中甚至加熱才能實現）。進一步的對照試驗證明組氨酸殘基的存在必不可少，且修飾專一發生在組氨酸前一氨基酸的氨基上。

短鏈蛋白質促甲狀腺激素釋放激素在醋酸銅催化下合成N-芳基化得到化合物

得到此結果后，作者擴大了肽鏈以及硼酸化合物的多樣性。如下圖所示，Leuprolide（4）是一個與TRH類似N末端為Glp的多肽，對芳基硼酸及烯基硼酸的適應性都非常好。而另一多肽angiotensin I（5）相對比較惰性，但烯基硼酸對此多肽相對于芳基硼酸活性要好很多。另外由于angiotensin I另一H6組氨酸的存在，會有混合產物出現，這也是此方法的一個缺陷（多個組氨酸存在影響定位）。

嘗試了不同長度的多肽后，作者用了蛋白質溶菌酶（lysozyme，～14 kDa）作為底物，并選用三種不同的芳基三氟硼酸鹽（化合物15、16、17）進行14位精氨酸（15位為組氨酸）的定點修飾。化合物15和16修飾的產物可以通過Click Chemistry與coumarin進行熒光顯色，化合物17可以與脫硫生物素pull-down并通過affinity purification，得到的修飾后蛋白質的分子量符合預期（因為只有一個組氨酸所以是單一位點修飾）。