Jackson ImmunoResearch二抗常見應用之流式細胞術

來源：作者：人氣：-發表時間：2018-06-26 11:06:00【大中小】

在流式細胞術間接免疫熒光標記的實驗中，二抗的選擇對實驗是否能順利開展有著重要的影響。Jackson高品質的流式二抗產品，可提供R-PE、APC、PerCP以及各種Alexa Fluor熒光標記、針對不同免疫球蛋白及亞型的二抗產品，并能提供完整IgG和F(ab')₂片段兩種形式的二抗。

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流式細胞術（Flow Cytometry,FC）的介紹

流式細胞術（Flow Cytometry,FC）是對單個細胞理化特性進行快速、精確的分析和分選的技術。這種技術可以用來對流過光學或電子檢測器的一個個細胞進行連續的多種參數分析，包括：細胞 DNA含量、細胞體積、蛋白質含量、酶活性、細胞膜受體和表面抗原等。

二抗和流式細胞術間接免疫熒光標記法

流式細胞術可以用熒光標記好的一抗直接和細胞進行免疫標記反應，也可以間接的通過用熒光標記二抗和未標記的一抗結合進行。間接免疫熒光標記法的優點是：操作較簡單，費用低，只需要制備相關的一抗，二抗則可廣泛地選擇探針分子，使用戶能夠將所需的探針與一抗相匹配。

圖一流式細胞術直接標記（左）和間接標記（右）示意圖

流式細胞術二抗的形式

整個IgG分子還是F(ab’)₂片段，選擇哪種形式的二抗？

二抗形式的選擇會影響到實驗是否成功，整個IgG分子適應大多數情況，而在免疫熒光實驗中，F(ab‘)₂片段形式的二抗是更佳的選擇，因為F(ab')₂二抗可避免抗體的Fc部分與細胞上的Fc受體之間發生非特異性結合，可以幫助避免由靶外結合引起的背景。同時它們比完整抗體要小，因此穿透某些樣本的效果更好。

FabuLight-Fab片段二抗，Fc特異性反應

FabulLab抗體是Fab片段二抗，與IgG或IgM一抗的Fc受體特異性反應。它們可與9種不同的熒光團和生物素結合，并能在與細胞或組織孵育之前標記一抗。在流式細胞術和免疫組化實驗的操作過程中，孵育順序的調整減少了洗滌和孵育的步驟，從而節約時間并保護細胞。

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流式細胞術熒光染料的選擇

熒光染料的選擇取決于很多實驗變量。

儀器的能力

激發光源：是否可以激發所選的熒光染料

檢測器：是否可檢測熒光染料的發射波長

實驗的樣本

高表達量的抗原幾乎可以用熒光染料標記抗體檢測，而較低表達的抗原則需要用較高S/N比值的熒光染料標記的抗體檢測。常用熒光的強弱如下：PE>APC>PE-Cy7>Percy-Cy5.5>FITC>APC-Cy7。

不同細胞群自發熒光水平的強弱，自發熒光水平強的則選擇發射波長長的染料（如APC），自發熒光水平弱的則可選擇FITC。

靈敏度的要求

即區分背景和弱陽信號的能力，而背景信號則取決于檢測器的電子噪音，其他檢測器的信號干擾等。

顏色分離度的要求

使用多種熒光染料時，要盡量減少熒光染料光譜的重疊。

FC常用的熒光探針的參數

Fluorophore 激發峰(nm) 發射峰 (nm)

Alexa Fluor® 488 493 519

FITC 492 520

R-Phycoerythrin R-PE many, 488 580

Allophycocyanin APC many, 650 670

Peridinin-Chlorophyll-protein, PerCP many, 488 675

Fluorophore	激發峰(nm)	發射峰 (nm)
Alexa Fluor® 488	493	519
FITC	492	520
R-Phycoerythrin R-PE	many, 488	580
Allophycocyanin APC	many, 650	670
Peridinin-Chlorophyll-protein, PerCP	many, 488	675

圖二分別為熒光探針的激發光譜（左）和發射光譜（右），分別為Alexa Flor®488 /FITC（Green）、R PE（紅色）、PerCP（藍色）、Alexa Flor®647（黑色）和APC（棕色）

圖二熒光探針的激發光譜（左）和發射光譜（右）

流式細胞術中Jackson二抗的使用

流式細胞術中建議的稀釋濃度如下表所示

產品類型	稀釋濃度
未標記的完整分子IgG和F(ab')₂片段二抗	10 - 20 µg / ml
未標記的Fab片段二抗	20-40µg/ml
所有Alexa Fluor®,DyLight,以及Cy3標記的[IgG, F(ab')₂, Fab]	1:100 - 1:800
香豆素,Cy2,FITC,TRITC,RRX以及德克薩斯紅標記的[IgG, F(ab')₂, Fab]	1:50 - 1:200
Cy5標記的[IgG, F(ab')₂, Fab]	1:100 - 1:400
藻紅蛋白和別藻藍蛋白標記的[IgG, F(ab')₂, 鏈霉親和素]	1:50 - 1:200
多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質復合物標記的[IgG, F(ab')₂, 鏈霉親和素]	1:25 - 1:100
生物素-SP標記的[IgG, F(ab')₂] (使用熒光標記鏈霉親和素)	1:200 - 1:1,000
所有Alexa Fluor®, DyLight 405以及Cy3標記的鏈霉親和素	0.5 - 2 µg / ml
Cy5標記的鏈霉親和素	0.5 - 2 µg / ml
所有其他熒光探針標記的鏈霉親和素	2 - 5 µg / ml

部分流式二抗產品列表

標記物	親和純化F(ab')₂片段化驢抗山羊IgG (H+L)二抗（經雞，豚鼠，倉鼠，馬，人，小鼠，兔，大鼠血清吸附）	親和純化F(ab')₂片段化山羊抗人IgG (H+L)二抗，與Fcγ片段特異性反應（經牛，馬，小鼠血清吸附）	親和純化F（ab’）₂片段化山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗（經人，牛，馬，兔，豬血清吸附）
未標記	0.5 mg 705-006-147	1.0 mg 109-006-098	1.0 mg 115-006-146
生物素-SP	0.3 ml 705-066-147	0.5 ml 109-066-098	0.5 ml 115-066-146
Alexa Fluor® 488	0.3 mg 705-546-147	0.75 mg 109-546-098	0.75 mg 115-546-146
Fluorescein (FITC)	0.3 mg 705-096-147	1.0 mg 109-096-098	1.0 mg 115-096-146
R-Phycoerythrin	1.0 ml 705-116-147	1.0 ml 109-116-098	1.0 ml 115-116-146
Allophycocyanin (APC)	0.5 ml 705-136-147	0.5 ml 109-136-098	0.5 ml 115-136-146
Alexa Fluor® 647	0.3 mg 705-606-147	0.75 mg 109-606-098	0.75 mg 115-606-146
PerCP	0.5 ml 705-126-147	0.5 ml 109-126-098	0.5 ml 115-126-146