Jackson ImmunoResearch二抗常見應(yīng)用之流式細(xì)胞術(shù)

來源：作者：人氣：-發(fā)表時間：2018-06-26 11:06:00【大中小】

在流式細(xì)胞術(shù)間接免疫熒光標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)中，二抗的選擇對實(shí)驗(yàn)是否能順利開展有著重要的影響。Jackson高品質(zhì)的流式二抗產(chǎn)品，可提供R-PE、APC、PerCP以及各種Alexa Fluor熒光標(biāo)記、針對不同免疫球蛋白及亞型的二抗產(chǎn)品，并能提供完整IgG和F(ab')₂片段兩種形式的二抗。

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流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry,FC）的介紹

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry,FC）是對單個細(xì)胞理化特性進(jìn)行快速、精確的分析和分選的技術(shù)。這種技術(shù)可以用來對流過光學(xué)或電子檢測器的一個個細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)的多種參數(shù)分析，包括：細(xì)胞 DNA含量、細(xì)胞體積、蛋白質(zhì)含量、酶活性、細(xì)胞膜受體和表面抗原等。

二抗和流式細(xì)胞術(shù)間接免疫熒光標(biāo)記法

流式細(xì)胞術(shù)可以用熒光標(biāo)記好的一抗直接和細(xì)胞進(jìn)行免疫標(biāo)記反應(yīng)，也可以間接的通過用熒光標(biāo)記二抗和未標(biāo)記的一抗結(jié)合進(jìn)行。間接免疫熒光標(biāo)記法的優(yōu)點(diǎn)是：操作較簡單，費(fèi)用低，只需要制備相關(guān)的一抗，二抗則可廣泛地選擇探針分子，使用戶能夠?qū)⑺璧奶结樑c一抗相匹配。

圖一流式細(xì)胞術(shù)直接標(biāo)記（左）和間接標(biāo)記（右）示意圖

流式細(xì)胞術(shù)二抗的形式

整個IgG分子還是F(ab’)₂片段，選擇哪種形式的二抗？

二抗形式的選擇會影響到實(shí)驗(yàn)是否成功，整個IgG分子適應(yīng)大多數(shù)情況，而在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，F(ab‘)₂片段形式的二抗是更佳的選擇，因?yàn)?span style="font-size:14px;">F(ab')₂二抗可避免抗體的Fc部分與細(xì)胞上的Fc受體之間發(fā)生非特異性結(jié)合，可以幫助避免由靶外結(jié)合引起的背景。同時它們比完整抗體要小，因此穿透某些樣本的效果更好。

FabuLight-Fab片段二抗，F(xiàn)c特異性反應(yīng)

FabulLab抗體是Fab片段二抗，與IgG或IgM一抗的Fc受體特異性反應(yīng)。它們可與9種不同的熒光團(tuán)和生物素結(jié)合，并能在與細(xì)胞或組織孵育之前標(biāo)記一抗。在流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化實(shí)驗(yàn)的操作過程中，孵育順序的調(diào)整減少了洗滌和孵育的步驟，從而節(jié)約時間并保護(hù)細(xì)胞。

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流式細(xì)胞術(shù)熒光染料的選擇

熒光染料的選擇取決于很多實(shí)驗(yàn)變量。

儀器的能力

激發(fā)光源：是否可以激發(fā)所選的熒光染料

檢測器：是否可檢測熒光染料的發(fā)射波長

實(shí)驗(yàn)的樣本

高表達(dá)量的抗原幾乎可以用熒光染料標(biāo)記抗體檢測，而較低表達(dá)的抗原則需要用較高S/N比值的熒光染料標(biāo)記的抗體檢測。常用熒光的強(qiáng)弱如下：PE>APC>PE-Cy7>Percy-Cy5.5>FITC>APC-Cy7。

不同細(xì)胞群自發(fā)熒光水平的強(qiáng)弱，自發(fā)熒光水平強(qiáng)的則選擇發(fā)射波長長的染料（如APC），自發(fā)熒光水平弱的則可選擇FITC。

靈敏度的要求

即區(qū)分背景和弱陽信號的能力，而背景信號則取決于檢測器的電子噪音，其他檢測器的信號干擾等。

顏色分離度的要求

使用多種熒光染料時，要盡量減少熒光染料光譜的重疊。

FC常用的熒光探針的參數(shù)

Fluorophore 激發(fā)峰(nm) 發(fā)射峰 (nm)

Alexa Fluor® 488 493 519

FITC 492 520

R-Phycoerythrin R-PE many, 488 580

Allophycocyanin APC many, 650 670

Peridinin-Chlorophyll-protein, PerCP many, 488 675

Fluorophore	激發(fā)峰(nm)	發(fā)射峰 (nm)
Alexa Fluor® 488	493	519
FITC	492	520
R-Phycoerythrin R-PE	many, 488	580
Allophycocyanin APC	many, 650	670
Peridinin-Chlorophyll-protein, PerCP	many, 488	675

圖二分別為熒光探針的激發(fā)光譜（左）和發(fā)射光譜（右），分別為Alexa Flor®488 /FITC（Green）、R PE（紅色）、PerCP（藍(lán)色）、Alexa Flor®647（黑色）和APC（棕色）

圖二熒光探針的激發(fā)光譜（左）和發(fā)射光譜（右）

流式細(xì)胞術(shù)中Jackson二抗的使用

流式細(xì)胞術(shù)中建議的稀釋濃度如下表所示

產(chǎn)品類型	稀釋濃度
未標(biāo)記的完整分子IgG和F(ab')₂片段二抗	10 - 20 µg / ml
未標(biāo)記的Fab片段二抗	20-40µg/ml
所有Alexa Fluor®,DyLight,以及Cy3標(biāo)記的[IgG, F(ab')₂, Fab]	1:100 - 1:800
香豆素,Cy2,FITC,TRITC,RRX以及德克薩斯紅標(biāo)記的[IgG, F(ab')₂, Fab]	1:50 - 1:200
Cy5標(biāo)記的[IgG, F(ab')₂, Fab]	1:100 - 1:400
藻紅蛋白和別藻藍(lán)蛋白標(biāo)記的[IgG, F(ab')₂, 鏈霉親和素]	1:50 - 1:200
多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物標(biāo)記的[IgG, F(ab')₂, 鏈霉親和素]	1:25 - 1:100
生物素-SP標(biāo)記的[IgG, F(ab')₂] (使用熒光標(biāo)記鏈霉親和素)	1:200 - 1:1,000
所有Alexa Fluor®, DyLight 405以及Cy3標(biāo)記的鏈霉親和素	0.5 - 2 µg / ml
Cy5標(biāo)記的鏈霉親和素	0.5 - 2 µg / ml
所有其他熒光探針標(biāo)記的鏈霉親和素	2 - 5 µg / ml

部分流式二抗產(chǎn)品列表

標(biāo)記物	親和純化F(ab')₂片段化驢抗山羊IgG (H+L)二抗（經(jīng)雞，豚鼠，倉鼠，馬，人，小鼠，兔，大鼠血清吸附）	親和純化F(ab')₂片段化山羊抗人IgG (H+L)二抗，與Fcγ片段特異性反應(yīng)（經(jīng)牛，馬，小鼠血清吸附）	親和純化F（ab’）₂片段化山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗（經(jīng)人，牛，馬，兔，豬血清吸附）
未標(biāo)記	0.5 mg 705-006-147	1.0 mg 109-006-098	1.0 mg 115-006-146
生物素-SP	0.3 ml 705-066-147	0.5 ml 109-066-098	0.5 ml 115-066-146
Alexa Fluor® 488	0.3 mg 705-546-147	0.75 mg 109-546-098	0.75 mg 115-546-146
Fluorescein (FITC)	0.3 mg 705-096-147	1.0 mg 109-096-098	1.0 mg 115-096-146
R-Phycoerythrin	1.0 ml 705-116-147	1.0 ml 109-116-098	1.0 ml 115-116-146
Allophycocyanin (APC)	0.5 ml 705-136-147	0.5 ml 109-136-098	0.5 ml 115-136-146
Alexa Fluor® 647	0.3 mg 705-606-147	0.75 mg 109-606-098	0.75 mg 115-606-146
PerCP	0.5 ml 705-126-147	0.5 ml 109-126-098	0.5 ml 115-126-146

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