羊駝事件后續(xù)-Jackson二抗常見應(yīng)用之多重標(biāo)記（Multiple-Labeling）

來源：作者：人氣：-發(fā)表時間：2018-05-21 09:21:00【大中小】

上回說到，Jackson的羊駝二抗均適用于多重標(biāo)記，當(dāng)然，不僅僅是羊駝，Jackson還有驢、山羊、小鼠等物種，可以提供更多選擇。

多重標(biāo)記（Multiple-Labeling）的原理

利用免疫學(xué)和細(xì)胞化學(xué)原理，在同一張切片上同時或先后采用不同的熒光色素來原位示蹤組織或細(xì)胞內(nèi)不同抗原大分子物質(zhì)的一項(xiàng)標(biāo)記染色技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)可以在同一張切片上顯示多種不同抗原成分（定性、定位、定量），因而使組織內(nèi)不同抗原成分相互間功能關(guān)系的觀察更為直觀。

多重標(biāo)記（Multiple-Labeling）的二抗選擇

在多重標(biāo)記（Multiple-Labeling）實(shí)驗(yàn)中，因?yàn)榍昂笾厝旧珓╅g有交叉干擾，以及可能會產(chǎn)生的非特異性雜交，所以，二抗的選擇至關(guān)重要。

熒光顏色的選擇

紅色和綠色的區(qū)分度較大，效果也比較理想，是常見的兩種熒光選擇。綠色熒光染料通常有Cy2、FITC、Dylight 488、Alexa Flour 488，紅色熒光染料則有Cy3、Rhodamine、Dylight 594、Cy5、APC等。因?yàn)榫G色和紅色熒光重合后顯示的是黃色，而橙色、黃色、紅色的很接近，因此三標(biāo)的時候，一般選擇藍(lán)色熒光。藍(lán)色熒光染料一般為AMCA或Dlight 405。

二抗類型的選擇

因?yàn)橐獧z測一個以上的抗原，所以二抗至少要滿足以下條件：a. 不相互識別（來源于相同的物種）；b. 不識別實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中其他的一抗；c.不識別實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中其他物種的免疫球蛋白；d. 不識別樣品中內(nèi)源性的免疫球蛋白。Jackson可用于多重標(biāo)記的熒光二抗，都經(jīng)過相近物種血清吸附處理，其針對目的種屬的特異性很高，同時針對其他非目的種屬的抗體分子的非特異性結(jié)合降到低值，同時避免了二抗與樣本以及其它一抗的非特異性雜交。

多重標(biāo)記（Multiple-Labeling）的實(shí)驗(yàn)示意圖

以小鼠組織切片，免疫熒光三標(biāo)實(shí)驗(yàn)為例

注意：每一步后徹底清洗，包括在第1步阻斷后。在沉重的或持續(xù)的背景下，在步驟4和步驟7可能需要進(jìn)一步的阻斷。不要用正常血清稀釋抗體或混合抗體以節(jié)省時間。

在這個案例中，步驟3, 6和9中使用的二抗彼此不識別，因?yàn)樗鼈兌际求H制造的。它們已經(jīng)被固相吸附，使得它們不識別在步驟2, 5和8中使用的其他主抗體。此外，它們不與可能存在于小鼠組織中的內(nèi)源性小鼠IgG反應(yīng)。

常用的多重標(biāo)記（Multiple-Labeling）二抗產(chǎn)品列表

標(biāo)記物	驢抗山羊 IgG (H+L)二抗（經(jīng)雞，豚鼠，倉鼠，馬，人，小鼠，兔，大鼠血清吸附）	山羊抗小鼠IgG (H+L) 二抗（經(jīng)人，牛，馬，兔，豬血清吸附）	驢抗兔 IgG (H+L) 二抗（經(jīng)牛，雞，山羊，豚鼠，倉鼠，馬，人，小鼠，大鼠，綿羊血清吸附）
未標(biāo)記	1.0 mg 705-005-147	1.5 mg 115-005-146	1.0 mg 711-005-152
辣根過氧化物酶	0.5 ml 705-035-147	1.5 ml 115-035-146	0.5 ml 711-035-152
堿性磷酸酶	0.5 ml 705-055-147	1.0 ml 115-055-146	0.5 ml 711-055-152
生物素	0.5 ml 705-065-147	1.5 ml 115-065-146	0.5 ml 711-065-152
DyLight™ 405	0.5 mg 705-475-147	1.0 mg 115-475-146	0.5 mg 711-475-152
AMCA	0.5 mg 705-155-147	1.5 mg 115-155-146	0.5 mg 711-155-152
Cy™ 2	0.5 mg 705-225-147	1.5 mg 115-225-146	0.5 mg 711-225-152
Alexa Fluor® 488	0.5 mg 705-545-147	1.0 mg 115-545-146	0.5 mg 711-545-152
Fluorescein (FITC)	0.5 mg 705-095-147	1.5 mg 115-095-146	0.5 mg 711-095-152
Cy™ 3	0.5 mg 705-165-147	1.5 mg 115-165-146	0.5 mg 711-165-152
Rhodamine (TRITC)	0.5 mg 705-025-147	1.5 mg 115-025-146	0.5 mg 711-025-152
Rhodamine Red-X™	0.5 mg 705-295-147	1.5 mg 115-295-146	0.5 mg 711-295-152
Alexa Fluor® 594	0.5 mg 705-585-147	1.0 mg 115-585-146	0.5 mg 711-585-152
Cy™ 5	0.5 mg 705-175-147	1.5 mg 115-175-146	0.5 mg 711-175-152
Alexa Fluor® 647	0.5 mg 705-605-147	1.0 mg 115-605-146	0.5 mg 711-605-152