近日，中科院南海海洋所張長生團隊與中國海洋大學朱偉明教授、加拿大拉瓦爾大學Rong Shi教授、中科院廣州生物醫藥與健康研究院劉勁松研究員經過多年合作研究，詳細解析了免疫抑制劑淺藍霉素A的生物合成途徑，揭示了淺藍霉素生物合成中獨特的“底物回補”機制，為次級代謝產物基因簇中未知功能基因的研究提供了新思路，相關成果在Chemcial Science （2016, DOI: 10.1039/C6SC00771F）和ACS Chemical Biology（2016, 11, 943-952）等期刊上發表。

“補救”（salvage）或“回補”（recycling） 途徑是生物初級代謝中常見現象，涉及到核苷酸、輔酶、四氫喋呤、氨基酸、維生素和鞘脂等分子的生物合成。“補救”途徑是生物體為了適應生存需要，將已分解 的部分代謝產物加以再次利用，派生出支路合成途徑以合成生物體所需的生物分子，是對“從頭合成”的一種有效補充。但“補救”或“回補”途徑在次級代謝生物 合成過程中非常罕見。

淺藍霉素（CRMs）是一系列含有獨特二聯吡啶環結構的化合物，主要由海洋放線菌Actinoalloteichus cyanogriseus WH1-2216-6產生，具有抗菌和抗腫瘤等生物活性，其中淺藍霉素A（CRM A）具有良好的免疫抑制活性，其免疫抑制活性10倍優于臨床藥物環孢霉素A。因此，CRM A正被美國的Nostrum制藥公司作為新型免疫抑制劑的藥物先導進行臨床研發。

闡明CRM A的生物合成途徑是將組合生物合成技術應用于CRM A結構改造和產量優化的前提。研究人員從海洋放線菌A. cyanogriseus WH1-2216-6中克隆和鑒定了CRM A的生物合成基因簇，闡明了CRM A中二聯吡啶環的骨架結構起源于雜合的聚酮合酶/非核糖體肽合成酶（PKS/NRPS）途徑，并發現了一種獨特的生物合成策略。通過氨基水解酶切除保護基團（L-亮氨酸），確保生物合成途徑往下游進行，揭示CRM A生物合成中的CrmG催化的氨基轉移過程、二元組分單加氧酶CrmH催化的肟基形成機制和CrmM催化的甲基化過程，從而完整解析了CRM A生物合成的后修飾過程（圖1）。

 
圖1. 淺藍霉素A（CRM A 1）的生物合成基因簇及其生物合成途徑

氨基轉移酶復雜的“乒乓”轉氨機制導致CrmG轉氨過程非常緩慢，同時發現CrmH催化產生的產物(Z)-CRM H6極不穩定，自發脫肟生成醛基，兩個方面的原因導致了醛基化合物CRM M 4在細胞內會大量累積。而醛基產物往往會與細胞內其他蛋白的胺和硫醇發生加成反應產生毒性，為消除毒性，醛基會在細胞內被還原成酸或醇。在crmG突變株中發現的累積產物是CRM P 7而不是預想的產物CRM M 4。在CRM生物合成基因簇的末端存在一個編碼核黃素氧化酶的基因crmK，其突變株仍能生產CRM A 1，表明crmK在淺藍霉素A的生物合成過程中是非必須基因。意外的是，在crmK突變株中同時發現了副產物CRM P 7。體外生化實驗證實CrmK能夠以CRM P 7為底物進行兩步連續的氧化反應，順次生成CRM M 4和CRM O 3。酶動力學研究表明第二步氧化反應CRM M 4至CRM O 3在細胞內很難發生，這樣即保證了副產物CRM P可以被重新利用，同時又避免了過度氧化導致能量的浪費（圖2）。晶體結構解析顯示CrmK采用兩個獨立的催化位點保證CRM P 7到CRM M 4的轉化，為CrmK高效催化醇到醛提供了進一步的理論依據。

圖2. 淺藍霉素A生物合成中底物補償機制的發現

上述成果主要由朱義廣博士、徐進新博士、付鵬博士和梅顯貴等完成，獲得了國家自然科學基金委、科技部、中科院和廣東省等的項目資助。

(1) Zhu, Y#., Picard, M#., Zhang, Q., Barma, J., Despres, X., Mei, X., Zhang, L., Duvignaud,J., Couture, M., Zhu, W., Shi,Rong*., Zhang, C*. Flavoenzyme CrmK-mediated substrate recycling in caerulomycin biosynthesis. ChemicalScience. 2016, DOI: 10.1039/C6SC00771F
http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2016/SC/C6SC00771F

(2) Zhu, Y#., Xu, J#., Mei, X#., Feng, Z., Zhang, L., Zhang, Q., Zhang, G., Zhu, W*., Liu, J*., Zhang, C*. Biochemical andstructural insights into the aminotransferase CrmG in caerulomycin biosynthesis. ACS Chemical Biology. 2016,11(4): 943-952, DOI: 10.1021/acschembio.5b00984
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acschembio.5b00984

(3) Fu, P#., Zhu, Y#., Mei, X., Wang, Y., Jia, H., Zhang, C*., Zhu, W*. Acyclic congeners from Actinoalloteichuscyanogriseus provide insights into cyclic bipyridine glycoside formation. Organic Letters. 2014, 16(16): 4264-4267.

(4) Zhu, Y., Zhang, Q., Li, S., Lin, Q., Fu, P., Zhang, G., Zhang, H., Shi, R., Zhu, W*., Zhang, C*. Insights into caerulomycina biosynthesis: a two-component monooxygenase CrmH-catalyzed oxime formation. Journal of theAmerican Chemical Society. 2013, 135(50): 18750-18753

(5) Zhu, Y#., Fu, P#., Lin, Q., Zhang, G., Zhang, H., Li, S., Ju, J., Zhu, W*., Zhang, C*. Identification of caerulomycin agene cluster implicates a tailoring amidohydrolase. Organic Letters. 2012, 14(11): 2666-2669.