Nature：抗體正在誤導科學界

來源：生物谷作者：人氣：-發表時間：2016-01-07 08:45:00【大中小】

一大堆利用抗體標記神經遞質（受體）的論文來襲，抗體正在誤導科學界

1994年到2011年間，《比較神經學》（Comparative Neurology）期刊的主編Clifford Saper經常看到一大堆利用抗體標記神經遞質及其受體位置的論文。2000年前后，基因敲除小鼠在生物領域大受歡迎，但結果令人不安。這提醒了Clifford Saper一個事實：抗體正在誤導科學界。

Clifford Saper先生現在是波士頓貝絲·以色列·迪肯尼斯醫療中心（Beth Israel Deaconess Medical Center,BIDMC）神經部門主席，根據他的回憶：理論上，基因敲除動物的染色結果應該和對照組小鼠的染色結果存在很大差別；但那時候他收到的論文中很多照片結果幾近相同，于是乎越來越多的論文被撤稿。不過Saper團隊也意識到，他們缺乏系統的方法來評估這些使用抗體的論文。

為此，Saper領銜了其所在的期刊進行革命并提出了要求作者提供論文中使用的抗體的廣泛驗證數據的原則。Saper在接受Nature采訪時表示：盡管這條對文章的嚴謹性有很大好處，但對于論文的投稿與約稿不利，很多作者會覺得麻煩而選擇投稿到其它雜志。但雜志社的堅持和努力最終形成了JCN抗體數據庫——一個包含幾千個可信賴的神經解剖學抗體的database。

處于困境的抗體市場：多抗、多抗、重組抗體孰優孰劣？

如今，科研者仍然不斷遭遇抗體的悲劇。最常見的是：購買的用于檢測蛋白X的抗體優先與蛋白Y結合（甚至可能完全不與X結合）；可重復性差，用新抗體重復以前的實驗，發現結果無法重復。一個好項目因此擱淺，抗體的不可靠性問題非常讓人警醒。

同一個抗體在幾次平行實驗里得出的結果不同，將會產生災難性的結果，而導致這一結果卻可能與抗體的生產過程有關。特異性不足、敏感度和批次差異性等導致了錯誤的科研發現和大量的科研精力浪費；抗體的不可靠性造成了癌癥、代謝、老化、免疫學和細胞信號轉導以及任何研究復雜的生物分子的領域的巨大損失；因抗體而造成的、在時間和資源方面的浪費非常巨大。

多克隆抗體是通過收集經過目標抗原刺激動物獲得免疫后的血液而制成的（只要這只動物還活著，就能夠一直提供多克隆抗體）；單克隆抗體是通過宿主動物接受目標蛋白免疫，然后提取出能識別并對該抗原發生響應的B細胞，使其與骨髓瘤細胞發生融合，從而成為可永久培養的細胞，從而不斷產生目的抗體。

相比之下，重組抗體不同于傳統的單克隆抗體，因為它們的制備不需要動物。相反，通過檢測產生該抗體的基因序列（通過對動物的免疫細胞進行測序、或自己設定序列，檢測產生的蛋白是否符合目標蛋白）；再將該基因插入到合適的細胞株中，從而產生抗體。由于抗體是確定的，即使原始細胞株死亡或發生突變，也能通過基因插入，產生需要的細胞株。

位于蒙哥馬利已有40多年銷售多克隆抗體的經歷的Bethyl Laboratories的首席科學官Eric McIntush表示：學界對重組抗體也會有需求，他們不可能把資金投入到可能永遠不賣的產品中，因此公司計劃從2016年起銷售重組抗體。盡管多克隆抗體具有廣泛可用性，是目前研發最便宜的抗體，適用于制備一些研究較少的抗體。但隨著目標蛋白結構和功能的不斷明確，以及臨床轉化的需求，重組克隆抗體也將大有可為。

瑞士蘇黎世大學（University of Zurich）蛋白質工程學家Andreas Plückthu等人也認為，單克隆抗體和多克隆抗體最終會被“結構更明確”的重組抗體完全取代。他表示，許多蛋白質不能被現有的試劑識別，這是因為使用了結構不明確的多克隆抗體，因此他建議為什么不使用一些基因可識別或存儲的試劑呢？

出于對抗體質量的追求，由2007年發起的Protein Capture Regeants和2010年發起的Affinomics兩個公共基金資助的項目主要致力于檢測市面上銷售的抗體和蛋白結合試劑的質量。目前這兩個項目都已接近尾聲。結果顯示：某些抗體尤其是轉錄因子的抗體質量格外參差不齊，這些試劑領域的后續投資會取得較高的回報率。

技術的進步和科學界的需求或將終結抗體亂象泥潭

抗體是生命科學領域最常用的工具之一，經常在 Western blot中揭示細胞或組織樣本中特定蛋白質的表達量的多少。此外，抗體也被用于免疫組化和免疫熒光染色，以便于在顯微鏡下可視化地觀察蛋白，以及其它各類基于抗體會與特定生物分子結合的實驗。

數以百計的抗體供應商讓人眼花繚亂

根據網上生物試劑商城Biocompare 2015年發表的一份報告：2015年科研用抗體市場規模達到25億美金且該數據仍在增長。由于多克隆抗體能以多種方式靶向目標分子，不僅容易制造，而且在不同背景下都能特異性地識別目標蛋白，因此市場份額較大。一項調查發現，2006年以來10000篇生物醫學論文引用了1293種多克隆抗體、755種單抗隆抗體和1種重組單克隆抗體。

據估計，每年因購買質量差的抗體導致的損失達到8億美金，更不要說所造成的無數的錯誤結論、不可解釋的（或曲解）實驗，以及浪費了的病人樣本和增加了的徒勞的研究時間。瑞典皇家理工學院的研究員Mathias Uhlén表示，因抗體而造成的挫敗已經太多了，是時候做出改進了，科學界對解決這個問題懷有很大興趣。

對抗體的不滿意激勵了各領域人士采取行動

2015年9月，Uhlén主持了由人類蛋白質組組織舉辦的抗體驗證工作組成立大會。同月，美國實驗生物學學會聯合會主辦的圓桌會議也探討了抗體問題，預計明年年初發布抗體選擇建議， NIH也參與了這次會議。從今年1月起，美國的基金分配將包含驗證實驗所需的抗體和其它關鍵資源質量的項目。只有這樣，基金申請人和基金評委在描述如何認證材料時才將有據可依。

抗體驗證工作組成立大會提出了一系列粗略的抗體重要標準草稿、評價體系以及驗證方法：包括利用包括基因敲降（knockdown）和基因敲除來驗證在目標蛋白缺乏的情況下，抗體是否仍會發生結合的方法；也包括把靶蛋白帶上熒光標簽、驗證抗體是否會與未標記的蛋白發生結合的手段；包括把新抗體和質量好的抗體進行比較；包括通過質譜儀來檢測分析抗體能與哪些分子結合；標準草稿將重點關注在特定實驗、特定上下文中抗體的效果。

經過特殊設計，只有當兩種抗體都結合于同一蛋白分子時，才會發出信號（紅色）

CRISPR–Cas9等新技術有助于抗體質量的驗證，擁有抗體驗證數據成公司優勢

抗體公司開始把有抗體驗證的數據看成是一大競爭優勢：一些抗體供應商發布了自己的驗證結果，新的技術也將有助于抗體質量的驗證。

英國的生命科學試劑供應商Abcam的首席執行官Alan Hirzel表示，為了驗證出售的抗體的質量，其公司使用了可以精細調整DNA的CRISPR–Cas9基因組編輯方法；并計劃在各種目標基因經CRISPR–Cas9技術切除的人類細胞系中驗證抗體，然后把每個抗體的驗證結果發布出來。

賽默飛世爾的首席科學官Klaus Lindpaintner表示：公司已經擁有能夠驗證抗體質量的技術，雖然在5-10年前他們根本沒辦法做到這點；

2015年6月，伯樂公司發布了一系列經過12種不同細胞系裂解物Western Blot實驗驗證的抗體；

2014年，抗體公司Proteintech利用小干擾RNA敲除基因的表達，然后驗證每一個新抗體產品的信號是否隨著蛋白表達的下降而下降。

NIH的抗體鑒定項目實驗室主任Gordon Whiteley表示，抗體鑒定項目的目的是鑒別癌癥生物學可靠的抗體清單，上述這些努力仍然不夠，只有極小一部分公司愿意展開驗證工作，并不是所有的公司都披露具體的測試條件，或何種情況下抗體的表現不佳，因此寫明測試條件和測試結果同樣重要。

抗體生產商Cell Signaling Technology公司的CSO Roberto Polakiewicz表示，檢測抗體并沒有最佳方法，開發抗體是一種科學試驗，需要有專業的人士來驗證抗體。倘若客戶不能基于驗證結果做出選擇，他們會傾向于尋找一種新的抗體，且抗體在一個特定實驗或特定樣本中的表現良好，并不意味著它在其它實驗里也能表現良好。

著眼現在：成立抗體驗證平臺收集重要信息

供應商要求使用者寫試用心得、用戶體驗

加州大學的信息科學家、資源識別倡議項目（Resource Identification Initiative，RII）組長Anita Bandrowski指出：從其他研究者的論文中得到信息是最高效的方法；但問題是只有不到一半的實驗論文具體描述了試劑使用的抗體貨號；即使作者們寫明了抗體貨號，公司可能會停止出售該產品。RII倡議建立一個有助于獨特的抗體識別體系，并說服幾十種雜志要求作者明確地寫明使用的抗體。

三種抗體（綠色）靶向同一線粒體蛋白質，右圖顯示了重組抗體與其他蛋白結合

目前已有十幾個專門幫助研究人員選擇抗體的網站，這些網站收集用戶對抗體性能的評價，并提供比較工具：科學出版社F1000旗下網站Antibody Validation Channel，允許研究人員把自己在抗體購買網站上的賬戶貼出來，甚至還能請同行針對抗體結果給出意見和建議；Biocompare雇了一個內容編輯，專門聯系研究者們，請他們對抗體寫評價。

一些抗體供應商，如St John's Laboratory，為研究人員提供使用產品，要求使用者寫試用心得；，抗體網上銷售平臺Antibodies-online安排了一個獨立的、第三方機構對抗體進行驗證；Antibodypedia網站的基因敲減計劃于2016年9月推出，研究者屆時可以通過抗體驗證掙到幾百美金：免費試用抗體，通過小干擾序列或CRISPR–Cas9等基因沉默技術來驗證抗體的信號強度隨著蛋白表達的下降而下降，然后把數據提交到網站，就可以獲得網站獎勵的幾百美金。

展望未來：利用程序來評估抗體質量，提供抗體性能的定量信息

只有供應商開始提供抗體的驗證數據，抗體質量才會有保障

國際結構基因組學聯盟（Structural Genomics Consortium, SGC）主任、多倫多大學Aled Edwards教授和同事們使用質譜檢測和比較1000多種抗體免疫沉淀的蛋白質，參考5個實驗室、歷時4年，花費了3百萬美元（不含各種人士的好心捐贈）建立了一個程序來評估抗體質量和提供抗體性能的定量信息，尤其是蛋白沉降實驗，即使用抗體將溶液中的目標蛋白沉淀下來。

挪威奧斯陸大學國家醫院的蛋白組學專家Fridtjof Lund-Johansen正在開發一個高效的、可同時檢測幾千種抗體的磁珠試驗法，或將細胞蛋白分離成許多不同的組分，然后用兩種不同的方法對每個組分中的蛋白質進行檢測分析：一種是質譜法（質譜數據作為參照，用于檢測芯片結果）；另一種是基于磁珠陣列、攜帶幾千種抗體的芯片。

瑞典烏普薩拉大學的蛋白組學技術開發商Ulf Landegren表示，對抗體的全面評估可能被過分解讀，他認為一種抗體與目標蛋白結合的能力遠比討論抗體是否能與正確的蛋白質以及其它分子結合有意義。當抗體結合非目標蛋白以外的蛋白時，有可能發生了交叉反應。由于與兩種抗體都發生結合的分子不太可能代表非目標蛋白，研究人員與其僅僅依賴一個抗體，不如成對地檢測能與同一目標蛋白不同部分結合的抗體。

然而，科學家們很難知道他們購買的抗體到底與哪個部分結合。供應商往往從不同來源獲取產品，并且不需要披露原始制造商。正如Salk Institute的神經科學家Paul Sawchenko提醒的那樣，供應商不能保證一個給定的抗體對每種組織樣本都有效。除非碰巧有人在和你一樣的樣本、一樣的實驗條件下驗證過該抗體的特異性，否則你需要自己去驗證這個抗體到底有沒有效。

綜上所述，抗體市場監管不足，產品質量沒有保障。只有當研究者們投入精力到抗體的選擇上，供應商才會開始提供抗體的驗證數據，抗體質量才有保障。