如何選擇合適的細(xì)胞培養(yǎng)基
細(xì)胞培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)室里常見和基本的實(shí)驗(yàn)了，但卻不是簡單的。別小看細(xì)胞培養(yǎng)，這里可蘊(yùn)含著大學(xué)問。有時(shí)候細(xì)胞狀態(tài)不好，轉(zhuǎn)染、藥篩這些實(shí)驗(yàn)根本就沒辦法做。影響細(xì)胞培養(yǎng)的因素很多，讓我們先從培養(yǎng)基和血清說起。
經(jīng)典的培養(yǎng)基有很多種，Nissui培養(yǎng)基使用廣泛、質(zhì)量穩(wěn)定，獲得一致好評。Nissui常用的培養(yǎng)基有：Eagle’s MEM ①，RPMI 1640 Medium②和DMEM ②等培養(yǎng)基。
Invitrogen(GIBCO)、thermo fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是應(yīng)用廣泛的培養(yǎng)基。其他如M199、IMDM、L15培養(yǎng)基等也用于某些細(xì)胞的培養(yǎng)。
◆ MEM是由Eagle’s基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BME)發(fā)展而來的，其中增加了組分的范圍及濃度。
◆ Dulbecco改良的BEM(DMEM)培養(yǎng)基是為小鼠成纖維細(xì)胞設(shè)計(jì)的，現(xiàn)在常用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。DMEM的氨基酸濃度是MEM的兩倍，維生素濃度是MEM的4倍，采用雙倍的HCO3-和CO2濃度起到更好的緩沖作用。初期的配方中葡萄糖含量為1000 mg/L，后來為了某些細(xì)胞的生長需要，將葡萄糖含量又調(diào)整為4500 mg/L，這就是大家常說的低糖和高糖了。
◆ aMEM含有附加的氨基酸、維生素以及核苷和脂肪酸，它可廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞類型，包括對營養(yǎng)成分要求苛刻的細(xì)胞。
◆ Ham’s F12是為在低血清濃度下克隆CHO細(xì)胞而設(shè)計(jì)的，現(xiàn)在也廣泛應(yīng)用于克隆形成率的分析及原代培養(yǎng)。F12還可以與DMEM等體積混合使用，得到一種高濃度與成分多樣化相結(jié)合的產(chǎn)物，這種培養(yǎng)基已應(yīng)用于許多原代培養(yǎng)及更難養(yǎng)的細(xì)胞系的培養(yǎng)。
◆ RPMI 1640培養(yǎng)基是專為淋巴細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。
以前經(jīng)常聽到有人問，這種細(xì)胞該用哪一種培養(yǎng)基呢?其實(shí)這個(gè)問題的答案可以很簡單，也可以好復(fù)雜。此話怎講？如果這種細(xì)胞是購自ATCC或其他的細(xì)胞庫，那很簡單，問供應(yīng)商就行了。或者找到相關(guān)的文獻(xiàn)，作為參考。Invitrogen網(wǎng)站上有一個(gè)Cell Line Database的工具，也很好用。選擇你感興趣的細(xì)胞類型，它就會彈出推薦的培養(yǎng)基、血清和轉(zhuǎn)染試劑等，有時(shí)還有優(yōu)化好的轉(zhuǎn)染步驟，很方便。Sigma網(wǎng)站上也有一個(gè)Media Expert，包括了培養(yǎng)基所有成分的功能描述、使用推介和參考文獻(xiàn)等，它還是一個(gè)解決問題能手，對于細(xì)胞培養(yǎng)中的常見問題，如細(xì)胞貼壁不好、培養(yǎng)基變色等，它都會列出可能的原因，并提供補(bǔ)救辦法。這個(gè)Expert果然不簡單!
但如果你是著手建立一種全新細(xì)胞的培養(yǎng)體系，根本找不到參考，那你就得花點(diǎn)時(shí)間自己試驗(yàn)了。萬事開頭難嘛。因?yàn)闆]有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)答案。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，先選MEM做貼壁細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI 1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)會是一個(gè)好的開始。你也可以購買幾種培養(yǎng)基來，然后花大約兩周的時(shí)間做一個(gè)簡單的細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)，來選擇其中較適合的。有時(shí)候你會驚訝地發(fā)現(xiàn)你的較佳培養(yǎng)條件與文獻(xiàn)報(bào)道的不同，就算是同一種培養(yǎng)條件，細(xì)胞的生長狀態(tài)也時(shí)好時(shí)壞，這是很正常的。因?yàn)樵噭⑺⒉煌柕难逯g都存在著差異。要提高培養(yǎng)基的穩(wěn)定性，可以從培養(yǎng)基和血清兩方面入手。
以前大部分實(shí)驗(yàn)室都是用干粉培養(yǎng)基，但配制過程就較為繁瑣，要溶解、調(diào)pH值，過濾，過程中可能會產(chǎn)生一些濃度誤差，而且有些實(shí)驗(yàn)室的水質(zhì)并不理想，所以培養(yǎng)的效果會有差異。如果使用液體培養(yǎng)基，這種人為的誤差會減少，因?yàn)楫吘故谴笈抗I(yè)化生產(chǎn)的，批間差會很小。大家是不是感覺液體培養(yǎng)基會貴很多，以前是這樣，但現(xiàn)在非也。HyClone和Invitrogen都在國內(nèi)建立了液體培養(yǎng)基的生產(chǎn)基地，生產(chǎn)和運(yùn)輸成本大幅降低，所以現(xiàn)在的價(jià)格也只是50-60元/500ml，比干粉培養(yǎng)基貴不了多少，而且還幫你省了過濾器和時(shí)間。
血清含有生長因子可促進(jìn)細(xì)胞的繁殖，含有附著因子可促進(jìn)細(xì)胞的貼壁，同時(shí)還具有抗胰酶活性。血清同時(shí)也是礦物質(zhì)、脂類及激素的來源。常用的血清有小牛血清、新生牛血清、胎牛血清和馬血清等。牛血清是按照采血時(shí)間的早晚來分類的。采血時(shí)間越早，營養(yǎng)物質(zhì)越豐富，所含抗體也越少，因而胎牛血清適合要求高的細(xì)胞系和克隆化培養(yǎng)。由于瘋牛病的原因，到目前為止，我國仍然禁止從北美洲、歐洲和日本等地區(qū)進(jìn)口牛血清，因此市面上的牛血清大多來自澳洲、南美洲，或是國產(chǎn)的。
而血清批次間的差別就是不可避免的，這種差異來源于不同的制備方法和除菌方法、動物的年齡差別及血清的儲存條件等，而且與取血動物的來源關(guān)系密切。不同的牧場、不同的氣候天氣及其他環(huán)境因素都可能影響血清的質(zhì)量。因此選好了一種血清就要盡可能長期使用它。在需要更換時(shí)，也要盡量保持與原有的一批血清相似。現(xiàn)在很多公司都提供血清預(yù)留，你一旦選定了某個(gè)批次的血清，可以備足一年的量，這樣可以避免很多麻煩。
血清固然是細(xì)胞培養(yǎng)中不可或缺的成分，但正如上文所說，血清的批間差異大，更換血清時(shí)需要做大量的測試以取保替換的血清與原來的相似。而血清的供應(yīng)也是必須要考慮的因素。由于氣候或瘋牛病的影響，說不定哪天血清就突然沒得賣了，那對實(shí)驗(yàn)的影響可非同小可。另外，血清的價(jià)格也很昂貴，雖說現(xiàn)在也有便宜的國產(chǎn)血清，但是高品質(zhì)的澳洲血清價(jià)格仍舊高企。因此，也有一些實(shí)驗(yàn)室開始換用無血清培養(yǎng)基。
無血清培養(yǎng)基(Serum-Free Media)，通常以SFM表示，顧名思義，就是在細(xì)胞培養(yǎng)中不需要添加血清，但是在某些應(yīng)用中可能要添加生長因子或細(xì)胞因子。無血清培養(yǎng)基中添加了血清的主要成分：粘附因子、生長因子、必需的營養(yǎng)物質(zhì)和激素等，能減少上述血清帶來的不利因素，使細(xì)胞培養(yǎng)的條件更穩(wěn)定。但它也不是完美的，從有血清培養(yǎng)過渡到無血清培養(yǎng)的條件并不像想象中那么直截了當(dāng)。處于發(fā)育的不同分化階段的細(xì)胞(例如干細(xì)胞與定向前體細(xì)胞相比)需要不同的配方，對生長因子和細(xì)胞因子的選擇尤為重要。而且在去除血清的同時(shí)，也去除了一些血清蛋白具有的保護(hù)、解毒作用，因此對試劑、水的純度和儀器清潔度的要求更高。另外，它的價(jià)格也比普通的培養(yǎng)基貴很多。
現(xiàn)在有很多廠家生產(chǎn)無血清培養(yǎng)基。GIBCO這個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的金字招牌當(dāng)然少不了，它也是較早研制無血清培養(yǎng)基的。目前已經(jīng)開發(fā)了ES細(xì)胞、雜交瘤、CHO、293、昆蟲細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。上個(gè)月還推出了首個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，能使MSC維持未分化狀態(tài)超過9代。HyClone公司也有CHO、293、雜交瘤細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、病毒疫苗(vaccine)細(xì)胞的多種無血清培養(yǎng)基。Sigma則剛剛收購了澳大利亞JRH公司，有了JRH的EX-CELL系列，無血清培養(yǎng)基的選擇也更多了。
這么多種，要選擇起來也是個(gè)頭疼的事情。除了部分培養(yǎng)基是公開配方的，如用于培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的MCDB 131(Sigma)，大部分液體培養(yǎng)基都是專利配方的，也就是說其中的成分是保密的。那么你只能是檢索文獻(xiàn)、讓供應(yīng)商推薦，然后用自己的細(xì)胞做幾次傳代培養(yǎng)來選出合適的培養(yǎng)基。畢竟實(shí)踐出真知嘛。
P.S. 附上一些細(xì)胞培養(yǎng)中的小Tip，可能會對您有所啟發(fā)。(部分摘自Invitrogen的中文Focus)
● 切記，細(xì)胞培養(yǎng)基的儲存條件是2-8攝氏度。如果細(xì)胞培養(yǎng)基不小心被凍，您應(yīng)該融化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。
● 貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基，可能在放置幾天后顏色變紫。這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時(shí)，碳酸氫納導(dǎo)致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘，來校正溶液的pH值(確定松開瓶口以保證氣體交換)。
● 當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素(antibiotic)時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素(antibiotic)。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素(antibiotic)不被滅活，可能對于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。
● 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素(antibiotic)時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股?antibiotic)和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。
● 總之，大部分添加物和試劑只能凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。
● 血清的熱滅活在免疫分析時(shí)可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。熱滅活是以往公認(rèn)的操作步驟，并沒有確鑿的證據(jù)說明這樣做是有益的。相反，對大部分細(xì)胞而言，GIBCO和HyClone都不推薦熱滅活血清。因?yàn)榧訜峥赡苁寡逯械某恋碓黾樱鼓`以為污染。
● 如何避免血清中沉淀物的產(chǎn)生?
1. 解凍血清時(shí)，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。并隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。
2. 請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。
3. 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。
4. 若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過高，時(shí)間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。
● 在進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，我們強(qiáng)烈推薦進(jìn)行臺盼蘭活性記數(shù)。研究者常常通過一個(gè)簡單的稀釋(1∶4或1∶2)進(jìn)行傳代，不進(jìn)行活性檢測，您可能接種比你認(rèn)為的低的多的濃度的細(xì)胞，這常常可能導(dǎo)致生長緩慢或培養(yǎng)物根本不生長。
● 貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液只能使用一周。胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。
● 在訂購的細(xì)胞到達(dá)后，應(yīng)立即復(fù)蘇，如果培養(yǎng)基還沒有準(zhǔn)備好，可將其放入液氮中，盡快復(fù)蘇。千萬不能放置在-20或-80℃的冰箱內(nèi)。
● 細(xì)胞復(fù)蘇往往是比較容易出問題的步驟。請?jiān)谟嗁徏?xì)胞時(shí)就向供應(yīng)商索取詳細(xì)的復(fù)蘇步驟，并仔細(xì)閱讀。有些供應(yīng)商就不推薦在復(fù)蘇時(shí)離心，對此類細(xì)節(jié)，應(yīng)特別留意。
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