· 榮膺Nature Methods雜志年度方法

· 無需抗體、直接檢測(cè)樣品中蛋白質(zhì)的含量

· 高特異性：同時(shí)分析蛋白上數(shù)個(gè)肽段

· 高靈敏度：可檢測(cè)低至amol級(jí)（10^-18）的蛋白信號(hào)

· 高通量: 可同時(shí)分析數(shù)十個(gè)蛋白質(zhì)含量

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的直接執(zhí)行者，生物學(xué)研究離不開分析蛋白質(zhì)的組成及含量變化。目前研究樣本中蛋白質(zhì)的含量都是間接方法：

1.基于抗體的檢測(cè)方法，如Western blotting、ELISA。這些方法的可靠性、靈敏度非常依賴于抗體的質(zhì)量。對(duì)那些沒有商業(yè)化的抗體的蛋白而言，無法用這些方法分析蛋白含量變化。

2.通過基因表達(dá)的變化預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)含量變化，但是mRNA和蛋白含量之間相關(guān)性并并不強(qiáng)，導(dǎo)致結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)偏差。

那么，有沒有一種方法無需通過抗體、或者轉(zhuǎn)錄水平這些間接的方法，而是能夠之間分析樣品中的含量呢？答案是肯定的, 這種方法就是我們要介紹的蛋白質(zhì)組技術(shù)。按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康目梢詫⒌鞍踪|(zhì)組技術(shù)分為兩大類：高通量蛋白質(zhì)組學(xué)和靶向蛋白質(zhì)組學(xué)，分別用于前期的差異蛋白篩選以及后續(xù)的目標(biāo)蛋白驗(yàn)證。例如針對(duì)臨床Biomarker的篩選，通常是首先應(yīng)從有限數(shù)目的臨床樣本中使用高通量的方法篩選出差異的目標(biāo)蛋白，然后使用靶向蛋白組技術(shù)針對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行擴(kuò)大樣本的驗(yàn)證，如下圖1：

高通量蛋白質(zhì)組和靶向蛋白質(zhì)組分別有各自不同的技術(shù)體系，以下對(duì)其主要的技術(shù)方法和特點(diǎn)做一個(gè)簡要介紹：

1.高通量蛋白質(zhì)組，主要使用的DDA（Data Dependent Acquisition）技術(shù)體系。DDA是基于鳥槍法（shotgun）的原理，因?yàn)樯飿悠分械鞍踪|(zhì)復(fù)雜程度極高，儀器不可能做到全部信號(hào)的采集，因此只能在每一個(gè)檢測(cè)循環(huán)中優(yōu)先采集相對(duì)較強(qiáng)的信號(hào)。這種方法有兩個(gè)局限性：第一，對(duì)于低強(qiáng)度的信號(hào)無法有效采集，限制了檢測(cè)的靈敏度；第二，檢測(cè)中“較高的信號(hào)”是一個(gè)相對(duì)的概念，不同樣品甚至不同批次的上機(jī)不可避免地產(chǎn)生一定的隨機(jī)性。

2.靶向蛋白質(zhì)組技術(shù)，顧名思義是只選取和檢測(cè)目標(biāo)蛋白相關(guān)的信號(hào)，忽略其他無關(guān)的信號(hào)，因此可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白定量的高特異性和高準(zhǔn)確性。如果我們將常用的高通量蛋白質(zhì)組技術(shù)方法理解為霰彈槍，那么靶向蛋白質(zhì)組技術(shù)就是狙擊槍（圖2）。

靶向蛋白質(zhì)組技術(shù)主要包括SRM/MRM和PRM兩種方法。SRM/MRM （Selected/ Multiple reaction monitoring）使用的是三重四級(jí)桿的質(zhì)譜，利用四級(jí)桿高選擇性的特點(diǎn)對(duì)母離子和子離子依次進(jìn)行分選，該技術(shù)在2012年的在Nature Methods中有詳細(xì)的總結(jié)論述¹，并被評(píng)為年度技術(shù)（Method of the Year 2012），可見其重要意義和應(yīng)用價(jià)值。在SRM/MRM的基礎(chǔ)上，2012年晚些時(shí)候，在MCP上報(bào)道了新型的靶向蛋白組技術(shù)——PRM（Parallel reaction monitoring）技術(shù)²，該技術(shù)結(jié)合了四級(jí)桿的高選擇性以及Orbitrap的高分辨、高精度特性，能夠?qū)Χ?jí)圖譜進(jìn)行獨(dú)立的鑒定，方法流程更加便捷（圖3）。與傳統(tǒng)的SRM/MRM相比，PRM在復(fù)雜背景下具有更優(yōu)秀的抗干擾能力和檢測(cè)靈敏度（圖4）。因此，PRM是更具優(yōu)勢(shì)和潛力的新型靶向蛋白質(zhì)組檢測(cè)方法，堪稱SRM/MRM的升級(jí)版。

PRM相比WB方法的優(yōu)勢(shì)

以上我們介紹了靶向蛋白質(zhì)組的技術(shù)原理和特點(diǎn)。那么，靶向蛋白質(zhì)組技術(shù)和傳統(tǒng)的基于免疫的方法（WB、ELISA）相比有什么優(yōu)勢(shì)呢？我們將二者的比較總結(jié)為以下的表格：

PRM應(yīng)用舉例

PRM因?yàn)榫哂芯_的鑒定和定量能力，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用與生命科學(xué)研究中，以下是一些例子：

1，普渡大學(xué)的研究者在PNAS上發(fā)表了通過血液外泌體尋找癌癥相關(guān)biomarkers的研究。研究人員高通量蛋白質(zhì)組技術(shù)尋找出差異蛋白的磷酸化位點(diǎn)，然后使用了PRM的方法進(jìn)行擴(kuò)大樣本的驗(yàn)證³，如下圖5，可以看出的確這四個(gè)潛在的biomarker在病人和健康人群體中有顯著的分布差異。

2，在植物研究領(lǐng)域中，常常因?yàn)槿狈ι虡I(yè)化的抗體而阻礙了研究的深入。而PRM技術(shù)的出現(xiàn)無疑是植物科研工作者的福音。2014年JPR上的一篇報(bào)道使用了PRM的方法來研究植物信號(hào)調(diào)節(jié)過程中的蛋白質(zhì)降解的現(xiàn)象⁴，如下圖6，可以看到針對(duì)FLS2的兩條unique peptide的PRM定量結(jié)果是非常一致的，這表明針對(duì)這個(gè)蛋白的定量結(jié)果高度可信。

實(shí)驗(yàn)流程

靶向蛋白質(zhì)組PRM的檢測(cè)服務(wù)，結(jié)合高通量蛋白質(zhì)組和修飾組檢測(cè)技術(shù)，能夠給大家的科研提供更全面的服務(wù)與支持。PRM檢測(cè)的基本流程包括：

在可行性評(píng)估階段，依據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道等進(jìn)行預(yù)先的評(píng)估，有效的評(píng)估是后續(xù)實(shí)驗(yàn)成功的重要保障。之后，通過實(shí)驗(yàn)和分析進(jìn)行相應(yīng)的方法學(xué)建立，然后開展正式的PRM檢測(cè)。
  
參考文獻(xiàn)：
1 Picotti, P. & Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods 9, 555 (2012).
2 Amelia C. Peterson, et al. Reaction Monitoring for High Resolution and High Mass Accuracy Quantitative, Targeted Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics Mcp 11, 1475 (2012).
3 Chen, I. H. et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 114, 3175 (2017).
4 Petra, M. et al. Targeted proteomics analysis of protein degradation in plant signaling on an LTQ-Orbitrap mass spectrometer. Journal of proteome research 13, 4246 (2014).