另一方面， "從釋放到外周血等體液中的、來自致病細胞的外泌體中，可以讀取致病細胞的分子譜"這一點已被證實了。以診斷為目的外泌體應用已經商業化。例如，在CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendments）認證的實驗室開發的，通過尿液中的外泌體同時檢測前列腺癌特異性PCA3非編碼RNA，ERG mRNA，SPDEF mRNA的測試（ExoDx® Prostate IntelliScore），并且可以作為LDT（Laboratory Developed Tests：實驗室內部研發、驗證、使用的體外診斷測試）進行國際委托技術服務。此外，Wako還建立了一項從血漿中一步分離外泌體DNA/RNA及cfDNA（circulating free DNA）的技術，并發表了一項從血液樣本中檢測非小細胞肺癌EGFR-T790M突變的檢測方法（ExoDx® EGFRT 790 M）。該突變導致60％接受EGFR抑制劑治療的肺癌患者產生耐藥性。有這種EGFR突變，就應及時替換Osimertinib等有效藥物進行治療，故快速的耐藥診斷很重要。通過對210例EGFR突變肺癌患者的對比試驗，目前認可的cfDNA診斷法（cobas® EGFR Mutation Test v2）檢測T790M的靈敏度是58%，特異性是80%；而ExoDx® EGFR T790M 檢測的靈敏度是92%，特異性是89%。相比之下，ExoDx® EGFR T790M 檢測可獲得更好的診斷結果。

在此背景下，無論是基礎生物學研究還是臨床應用，都需要實驗室之間能夠零差異再現的高純度外泌體，一種任一人能輕松分離和純化外泌體的工具是不可或缺的。特別是，如果研究對象是從血清和血漿樣本中提取純化的外泌體蛋白，則需要很高的純化水平。血清·血漿的蛋白濃度超過60mg/mL，還存在許多高分子量復合物如脂蛋白，即使是外泌體提取常用的超速離心沉淀法，仍然會存在大量血清游離蛋白（IgM，α2 -巨球蛋白，補體成分等）和脂蛋白。因此，通過LC/MS對超速離心法提取的血清蛋白進行定量蛋白質組分析時，幾乎所有含量都是血清游離蛋白，只檢測出了微量的外泌體蛋白。

除超速離心法外，外泌體的提取方法還有抗體親和法、聚合物沉淀法、凝膠過濾法以及從切除的組織浸液中直接回收的方法等。MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS（下文稱為MagCapture試劑盒）的原理是親和純化磷酯酰絲氨酸PS （磷酯酰絲氨酸是構成外泌體膜的脂質之一）。與其它方法相比具有各種各樣的優點。固定在磁珠上的Tim-4蛋白與PS在鈣離子存在的條件下結合，通過螯合劑洗脫，可以不洗脫非特異性磁珠結合蛋白而特異性洗脫外泌體，因此提取的純度很高。另外，只要磁珠純化操作可以順利進行，就不受樣本容量的限制，即使是用稀釋的樣本也同樣有效。此外，由于在沒有變性溶解的情況下進行洗脫，后續的粒子計數檢測、顯微鏡檢查和細胞給藥實驗等應用均可放心使用。

根據圖1A的方法，從相同血清中提取外泌體，并通過Orbitrap Fusion Lumos質譜儀進行綜合蛋白質組分析。結果顯示，超速離心提取外泌體的總蛋白質鑒定數為612種，MagCapture試劑盒提取外泌體的總蛋白質鑒定數為1,103種，后者是前者的約1.8倍（圖1B）。這是因為超速離心法的血清中殘留大量的游離蛋白質，掩蓋了微量外泌體來源的信號。此外，比較鑒定的蛋白質以及相對定量值，可以看出，MagCapture試劑盒提取的外泌體中，被認為是外泌體標記蛋白的恒定分子組合以及相對含量都要更多（圖2）。由此可見，通過試劑盒提取的外泌體純度遠高于現有的超速離心沉淀法。

使用高純度的外泌體，有利于闡明外泌體的功能以及探索診斷和治療藥物，使研究結果更具可信度。從外泌體提取的純度、靈活性、可重復性等方面來看，MagCapture試劑盒適合作為所有外泌體研究的起點。但是，通過該試劑盒回收的產物也是一組含有大量PS膜組分的無限定尺寸的集合，是否等同于其他現有研究指出的外泌體，還需要后期的組學分析來進行仔細評估和定義。隨著包括MagCapture試劑盒在內的提取純化技術以及檢測技術的發展，我們期待對外泌體的本質闡明和臨床應用的進一步發展。

圖1. 提取純度對外泌體蛋白質組分析的影響

A）通過超速離心沉淀法和MagCapture™Exosome Isolation Kit PS提取血清中的外泌體并進行質譜分析

B）鑒定出的蛋白數量和重疊部分

圖2. 鑒定外泌體蛋白質的定量頂視圖

A) MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS及B)超速離心沉淀法提取血清中外泌體的蛋白質組定量分析結果

B）收集并記錄了有報道作為外泌體標記物的蛋白。

公益基金會癌癥研究小組 植田 幸嗣

[1]	Zhang, H. et al. :"Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation", Nat. Cell Biol., 20, 332（2018）.
[2]	McKiernan, J. et al . :"A Novel Urine Exosome Gene Expression Assay to Predict High-grade Prostate Cancer at Initial Biopsy", JAMA. Oncol., 2, 882（2016）.
[3]	Castellanos-Rizaldos, E. et al . :"Exosomebased Detection of EGFR T790M in Plasma from Non-Small Cell Lung Cancer Patients", Clin. Cancer Res ., DOI : 10.1158/1078-0432. CCR-17-3369（2018）.
[4]	植田幸嗣：「プロテオーム解析から見たバイ オマーカーとしてのエクソソームとその特 徴」, 細胞工學, 32, 71（2013）.
[5]	Jingushi, K. et al. :"Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin", Int. J. Cancer , 142, 607（2018）.

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