Tim4蛋白固化磁珠，在金屬離子存在的條件下親和細胞外囊泡表面的磷酯酰絲氨酸（PS），然后使用含有EDTA的洗脫液進行洗脫，捕獲高純度的完整細胞外囊泡

●　通過PS親和分子回收   ●　低背景值   ●　在中性條件下通過螯合試劑進行溫和洗脫   ※　可獲得高純度，完整的外泌體

  ●　使用磁珠改進了操作
  ●　流程優化
  ※　高重復性

與其他提取方法相比
方法	外囊泡純度	囊泡狀態	可操作性	回收量
PS親和法	■■■	完整	簡便穩定	■■■
超速離心法	■■	完整	簡便	■■
聚合物沉淀法	■	完整	簡便快捷	■■■■
密度梯度離心法	■■■■	完整	復雜	■■
抗體親和法	■■■	不完整	簡便穩定	■■

  ●　可以純化高純度和完整的細胞外囊泡
  ●　可以從細胞上清液、血清、血漿和尿液中純化外囊泡
  ●　重復性高，回收量穩定
  ●　簡易操作（約3.5小時）
  ●　啟用多個樣品（無需超速離心）

產品名稱	包裝規格		保存條件
MagCapture™Exosome Isolation Kit PS	10次 （產品編號：293-77601）	2次 （產品編號：299-77603）	2-10°C
試劑盒成分 (1)鏈霉親和素磁珠 (2)生物素標記的外泌體捕獲 (3)外泌體捕獲免疫固定緩沖液 (4)外泌體結合增強劑(×500) (5)洗滌緩沖液 (6)外泌體洗脫緩沖液 (7)反應管	<10 次>  600 μL×1 管  100 μL×1 管  35 mL×1 瓶  500 μL×1 管  75 mL×2 瓶  5 mL×1 瓶  22 管	<2 次>  120 μL×1 管  20 μL×1 管  7 mL×1 瓶  100 μL×1 管  1 mL×1 瓶  1 管

使用該試劑盒，超離法和抗體親和法提取人血清的外泌體，接著用CD9和CD63抗體進行免疫印跡實驗。

抗CD9兔多抗，System Bioscience公司
抗CD63兔多抗，System Bioscience公司

分別從1mL的EDTA血漿、EDTA血漿（超濾更換緩沖液）、人血清中提取外泌體，進行WB檢測（抗Flotillin2抗體）。

抗Flotillin-2小鼠單抗（29/Fotillin-2），BD Bioscience公司

各1mL

各樣品結果分別對應150μL樣品量。從100μL提取物中取出15μL，添加5μL的4×SDS樣品緩沖液，全部上樣。

1mL人尿液分別通過本試劑盒、聚合物沉淀法、超離法進行外泌體回收，并做免疫印跡（WB）檢測（抗CD9抗體）。

抗CD9兔多抗，System Biosciences公司

各1mL

各樣品結果分別對應150 μL尿液樣品。從100 μL提取物中取出15 μL，加入5 μL的 4×SDS樣品緩沖液，全部上樣。

分別用本試劑盒、超離心法和聚合物沉淀法從K562（人慢性骨髓性白血病）細胞培養上清（無血清培養上清或10%Exosome-depleted FBS添加培養基）提取外泌體，分別比較三種方法的外泌體回收量和外泌體純度。

按照試劑盒的操作說明（反應時間：3小時），從1 mL經過離心處理（10,000×g，30min）的K562細胞培養上清（無血清培養基或10% Exosome-depleted FBS添加培養基※1）中提取外泌體。

超速離心法

將10 mL經過離心處理（10,000×g，30 min）的K562細胞培養上清（無血清培養基或10% Exosome-depleted FBS添加培養基※1）進行超離（110,000×g，70 min），用TBS緩沖液重懸沉淀物后，再進行超離（110,000×g，70 min），回收沉淀部分。

從1mL經過離心處理（10,000×g，30 min）的K562細胞培養上清（無血清培養基或10% Exosome-depleted FBS添加培養基※1）中，按照市售的A公司產品的操作說明（靜置時間：過夜）提取外泌體。

※1：110,000×g離心2小時，在不吸到沉淀的前提下回收上清。

分別用本試劑盒、超離法、聚合物沉淀法提取外泌體，用NanoSight LM10檢測外泌體片段的粒子直徑。另外，用最終濃度為2%的多聚甲醛固定提取到的外泌體片段（2~4×1010 particles），在透射電子顯微鏡進行分析。 

MagCapture™ 可提取到很多100 nm左右的粒子，在透射電子顯微鏡中也可以確認到很多細胞外囊泡。

用PS親和法、超離法和聚合物沉淀法從K562 細胞培養上清（無血清培養基）獲得樣品進行電泳。接著用銀染色和WB法（CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗體）進行實驗。

  抗CD63小鼠單抗（MEM-259）
  抗Flotillin-2 小鼠單抗（29/Flotillin-2），BD Bioscience公司
  抗Lamp-1小鼠單抗（25/Lamp-1），BD Bioscience公司

用MagCapture™ 外泌體提取試劑盒、超離法和聚合物沉淀法，從K562 細胞培養上清（10% 去外泌體 FBS補充培養基）獲得樣品進行電泳，用銀染法和WB法（CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗體）進行實驗。同時，對外泌體提取片段進行質譜測定，比較所有測定的多肽中來自K562細胞的人來源多肽的比例（由于添加到細胞培養基的FBS中牛蛋白聚集體是混雜的，所以人來源多肽的比率會下降）。

  抗CD63小鼠單抗（MEM-259）
  抗Flotillin-2小鼠單抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司
  抗Lamp-1小鼠單抗（25/Lamp-1），BD Bioscience公司
  健康人血清來源的外泌體中提取miRNA和mRNA的回收量比較

①運用不同方法提取外泌體并比較從中提取的microRNA和mRNA的回收量

通過超離法和PS親和法將EVs從正常人血清中分離，然后使用microRNA提取試劑盒（產品編號295-71701）提取RNA。通過qRT-PCR分析提取的RNA，并比較microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。

②運用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比較

運用PS親和法將EVs從正常人血清中分離，然后使用microRNA提取試劑盒（產品編號295-71701）或基于AGPC法的試劑提取RNA。通過qRT-PCR分析提取的RNA，并比較microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。

分別利用PS親和法、超離法、聚合物沉淀法，從含10% FBS（不含外泌體）的K562細胞培養上清液中提取外泌體。將提取樣品用10%聚丙烯酰胺電泳分離，剪切出全部的蛋白質條帶。然后在凝膠內進行消化，用LC-MS對蛋白質進行檢測。對上述三種方法提取的外泌體進行蛋白質組合的相關性比較。

比較通過MASS分析鑒定的前10個蛋白質

白色柱：源自外囊泡的人類蛋白質
灰色柱：來自FBS的牛蛋白污染物
紅 色：來自外囊泡的標記蛋白
樣品：K562細胞培養基（含有10%去除外泌體胎牛血清）

Protein Assay BCA Kit是利用二辛可寧酸（BCA）定量檢測溶液中的蛋白質濃度的試劑盒，是蛋白質定量檢測法中最通用的方法。其原理為，堿性條件下的蛋白質Cu2+離子被還原為Cu+。Cu+與BCA形成絡合物，即產生紫色螯合物，蛋白質濃度與紫色螯合物顏色深淺有關，通過測定562 nm處的吸光度，并與標準曲線做比照，即可定量溶液中的蛋白質濃度。

利用MagCapture™外泌體提取試劑盒從細胞培養上清液中提取外泌體，通過Protein Assay BCA Kit高靈敏的檢測外泌體中蛋白質濃度。

將通過MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取的25 μL外泌體溶液分注于96孔板中，加入 Protein Assay BCA Kit中試劑A和試劑B混合液200 μL。之后60℃孵育30分鐘，檢測560 nm吸光度（圖1）。結果表明，通過Protein Assay BCA Kit的高靈敏度檢測，可測定提取后外泌體中蛋白質濃度。

圖1. Protein Assay BCA Kit 檢測BSA的檢量線和提取的外泌體蛋白質濃度的檢測

由于外泌體蛋白質濃度相當低，因此BCA測定時不要稀釋樣品。
①　將BSA標準溶液按照250、125、62.5、31.25、15.625 μg／mL和空白對照，分別每孔25 μL加到96孔板中。
② 分別把提取的外泌體和洗脫緩沖液（空白）按照每孔25 μL加入96孔板。
③ 把200μL Protein Assay BCA Kit（產品編號：297-73101）的試劑A盒試劑B混合液（A:B=50:1）加入放有樣品的孔板中。
④ 60℃孵育30分鐘
⑤ 室溫條件下降低孔板溫度
⑥ 測定560 nm的吸光度

產品編號	產品名稱	包裝
訂購熱線：400-021-8158
297-73101	Protein Assay BCA Kit 蛋白測定試劑盒（二喹啉甲酸）	250次用
015-25613	2mg/mL Albumin Solution from Bovine Serum 2mg/mL 牛血清蛋白溶液	1 mL×10

用PKH67（Sigma公司）標記MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取的細胞外囊泡，Hela細胞導入確認

<外泌體PKH67標記>
1. MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取外泌體（實驗當天從K562細胞培養上清液提取外泌體）
2. 用BCA Assay和NanoSight檢測樣品的蛋白質濃度和粒子濃度
3. 將相當于5 μg*蛋白量的外泌體樣品溶液分裝至1.5 mL管中。
*請配制合適的使用量
4. 將2.0 μL的PKH linker溶解在0.25 mL的DiluentC中。…4×Dye solution*
*請配制合適的使用量
5. 添加1/3樣品量的4×Dye solution至樣品中，混合后在室溫中孵育5-10分鐘。
6. 根據附帶的操作說明用PBS平衡Exosome Spin Columns （MW 3000）（Thermo公司）。
7. 將100 μL樣品分別加入上述平衡后的旋轉柱*中，離心（最大添加量：100 μL）。
*準備必需的支數。
8. 將外泌體溶液*加入到已經接種好Hela細胞的培養皿中，24小時后用顯微鏡觀察并利用流式細胞儀進行分析。
*根據實驗調節外泌體添加量

圖1. PKH標記外泌體的細胞捕獲觀察

從16 mL K562培養上清液中超濾濃縮得到4 mL培養上清液作為樣品，通過PS親和法提取外泌體。
●　提取的外泌體蛋白質濃度：22.3 ng/μL
●　粒子濃度：1.2×108 particles/mL

將上述標記的外泌體溶液全部加入接種好的Hela細胞中，24小時后用熒光顯微鏡（左）和流式細胞儀（右）檢測捕獲情況。

Opti-MEM：取相同量用PKH標記后添加到細胞中作為陰性對照。

樣品預處理：對樣品進行1,200×g離心操作※1。如果要得到更高純度的外泌體，則按照下述步驟對樣品進行10,000×g離心操作※2。

下文是細胞培養上清、血清/血漿的預處理方法。其他體液樣品的預處理操作，請參考血清/血漿的實驗步驟，做適當調整。

用50 mL TBS 緩沖液對1 mL 已經經過離心處理的EDTA 血漿樣品進行緩沖液更換。
1. 把19 mL TBS 加進VivaSpin20（100K）中。
2. 把1 mL 離心過的EDTA 血漿上清添加在第1. 的VivaSpin20（100K）中，混勻。
3. 把第2. 的VivaSpin20（100K）在4℃下進行離心處理。
4. 減少上線的液體后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 緩沖液。
5. 4℃下離心處理。
6. 減少上面的液體后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 緩沖液。
7. 4℃下離心處理。
8. 減少上面的液體后，在VivaSpin20（100K）中追加11 mL TBS 緩沖液。
9. 4℃下離心處理直至樣品液量達到1 mL 以下。
10. 進行提取。