以外泌體為代表的細(xì)胞外囊泡是各個(gè)細(xì)胞釋放出的膜囊泡，它作為細(xì)胞間信息傳遞的使者和疾病生物標(biāo)志物，近年來(lái)受到了極高的關(guān)注wai。雖然近幾年有關(guān)外泌體的研究在各領(lǐng)域中不斷增長(zhǎng)，但實(shí)驗(yàn)技術(shù)尚在發(fā)展階段，還存在很多需要改善的問(wèn)題。FUJIFILM Wako開(kāi)發(fā)了一種新的親和分離法——"PS親和法"，與傳統(tǒng)方法相比，能從各種樣品中提取出完整且高純度的外泌體，而且，該技術(shù)還成功開(kāi)發(fā)出用于外泌體檢測(cè)的PS親和ELISA法）。

在研究外泌體時(shí)，為了評(píng)價(jià)分離和提取出的外泌體的生物活性，通常會(huì)對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物進(jìn)行投喂實(shí)驗(yàn)。利用熒光素標(biāo)記進(jìn)行可視化來(lái)確認(rèn)對(duì)象中含有外泌體并進(jìn)行追蹤，是一種常見(jiàn)的技術(shù)。但是，如上述所說(shuō)，外泌體的實(shí)驗(yàn)技術(shù)仍在發(fā)展，熒光素標(biāo)記還存在需要注意的問(wèn)題。本文講述的是使用了不同品牌的熒光標(biāo)記色素進(jìn)行外泌體標(biāo)記的研究，以及需要注意的問(wèn)題。

各品牌都將脂質(zhì)、核酸或細(xì)胞膜的熒光標(biāo)記試劑加以改造，使之成為包括外泌體在內(nèi)的細(xì)胞外囊泡的特異熒光標(biāo)記試劑。該標(biāo)記方法是讓從各個(gè)樣品中分離、提取出來(lái)的外泌體樣品與熒光色素進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)凝膠過(guò)濾或超濾裝置去除未反應(yīng)的熒光色素。在該熒光標(biāo)記的過(guò)程中，特別是去除未反應(yīng)的熒光標(biāo)記時(shí)，會(huì)因吸附而損失大量的外泌體樣品，同時(shí)，通過(guò)向外泌體樣品添加FUJIFILM Wako開(kāi)發(fā)的EV-Save™ Extracellular Vesicle Blocking Reagent（下面簡(jiǎn)稱(chēng)EV-Save），能強(qiáng)烈抑制吸附損失（圖1）。用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS從COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離、提取外泌體樣品，先用A公司的熒光標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記，然后用B公司的凝膠過(guò)濾柱去除未反應(yīng)色素。將獲得的熒光標(biāo)記外泌體樣品加入HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清中，經(jīng)過(guò)24小時(shí)的細(xì)胞吸收后，用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在熒光色素標(biāo)記時(shí)預(yù)先向樣品中加入EV-Save，結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào)比未添加EV-Save時(shí)大幅增強(qiáng)（圖1、A, B）。用PS Capture™ Exosome ELISA Kit后再比較凝膠過(guò)濾前后外泌體樣品的吸附損失， 未添加EV-Save的樣品在凝膠過(guò)濾后沒(méi)被檢測(cè)到外泌體表面標(biāo)記物CD63的信號(hào)，而添加了EV-Save的樣品則檢測(cè)到了CD63的信號(hào)，所以，EV-Save能有效抑制凝膠過(guò)濾引起的吸附損失（圖1、C）。

圖1．熒光標(biāo)記外泌體樣品的吸收確認(rèn)與EV-Save抑制吸附損失的效果

用A公司的熒光標(biāo)記試劑對(duì)MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS分離的COLO201來(lái)源外泌體樣品（1×10¹⁰particles）進(jìn)行標(biāo)記后，再用熒光顯微鏡（A）和流式細(xì)胞儀（B）確認(rèn)HeLa細(xì)胞吸收外泌體樣品的情況。
準(zhǔn)備同上的外泌體樣品（5×10⁹particles），可以用PS Capture™ Exosome ELISA Kit比較CD63信號(hào)來(lái)檢測(cè)凝膠過(guò)濾前后的損失（C）。

下面將對(duì)使用不同熒光標(biāo)記試劑的外泌體熒光標(biāo)記以及細(xì)胞的吸收能力進(jìn)行比較。這次使用的是A、B、C公司的熒光標(biāo)記試劑。用各種熒光標(biāo)記試劑熒光標(biāo)記以MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS從COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取的外泌體樣品，再確認(rèn)HeLa細(xì)胞對(duì)外泌體樣品的吸收情況（圖2、A, B）。熒光顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)吸收了用不同熒光標(biāo)記的外泌體（圖2、A），且根據(jù)流式細(xì)胞分析，比較無(wú)添加對(duì)照以及標(biāo)記Elution buffer的陰性對(duì)照，峰值位移大幅改變，所以能確定受體細(xì)胞吸收了熒光標(biāo)記的外泌體（圖2、B）。但是，用熒光標(biāo)記試劑來(lái)標(biāo)記1% BSA 溶液作為陰性對(duì)照，與其他樣品一樣加入細(xì)胞后，和熒光標(biāo)記的外泌體樣品進(jìn)行同樣的處理，在流式細(xì)胞分析中也觀(guān)察到了峰值的變化（圖2、B）。對(duì)此，各種熒光色素標(biāo)記試劑不僅對(duì)外泌體，同樣的原理它對(duì)蛋白也能進(jìn)行標(biāo)記，故在用作外泌體標(biāo)記試劑時(shí)，特異性是一個(gè)較嚴(yán)重的問(wèn)題。從上述結(jié)果可見(jiàn)，用市面上銷(xiāo)售的熒光標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記，或進(jìn)行細(xì)胞吸收外泌體的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)時(shí)，受體細(xì)胞中的熒光信號(hào)是外泌體本身的信號(hào)，還是外泌體分離時(shí)受污染的蛋白等雜質(zhì)來(lái)源的信號(hào)，解釋結(jié)果時(shí)需要特別注意，故在進(jìn)行細(xì)胞吸收外泌體的確認(rèn)驗(yàn)證時(shí)，外泌體樣品純度非常重要。

圖2．使用了各種熒光標(biāo)記試劑的外泌體標(biāo)記與外泌體被HeLa細(xì)胞吸收的確認(rèn)

用各種熒光標(biāo)記試劑對(duì)MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS分離的COLO201 來(lái)源外泌體樣品（1× 1010 particles）進(jìn)行標(biāo)記，再用熒光顯微鏡（A）和流式細(xì)胞儀（B）確認(rèn)HeLa細(xì)胞對(duì)外泌體樣品的吸收情況。另外，作為對(duì)照，還準(zhǔn)備了同樣進(jìn)行過(guò)熒光標(biāo)記處理的試劑盒附帶的Elution buffer和1%BSA 溶液，然后添加到細(xì)胞中（B）。

因此，通過(guò)FUJIFILM Wako PS親和法和超離法從相同量的培養(yǎng)上清樣品中分離、提取出外泌體樣品，再用A公司的熒光標(biāo)記試劑標(biāo)記外泌體樣品，進(jìn)行細(xì)胞吸收外泌體的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)（圖3）。熒光顯微鏡的分析結(jié)果表明，受體細(xì)胞吸收的由超離法分離、提取出的外泌體樣品比PS親和提取的外泌體樣品更多（圖3、A）。但是，詳細(xì)分析提取外泌體樣品時(shí)，盡管蛋白濃度和粒子數(shù)分析顯示出超離樣品含有更多的外泌體量，但是如果用PS Capture™ Exosome ELISA Kit檢測(cè)外泌體標(biāo)記物CD63信號(hào)，PS親和法分離、提取的樣品比用超離法分離、提取的外泌體樣品的一個(gè)粒子的CD63信號(hào)和純度更高（圖3、B）。使用雜質(zhì)多、污染嚴(yán)重的超離法制備外泌體樣品時(shí)，受體細(xì)胞吸收的信號(hào)實(shí)體不僅來(lái)源于外泌體，也可能來(lái)源于雜質(zhì)蛋白。

圖3．比較PS親和提取與超離提取外泌體的吸收的效率

用A公司的熒光標(biāo)記試劑對(duì)用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS和超離法分離的COLO201來(lái)源的外泌體樣品（8×10⁹particles）進(jìn)行標(biāo)記，然后在熒光顯微鏡下比較HeLa細(xì)胞吸收外泌體的效率（A）。各提取法配制的外泌體樣品，以BCA assay 檢測(cè)蛋白濃度，使用NanoSight的NTA檢測(cè)粒子數(shù)，同時(shí)，通過(guò)PS親和ELISA法檢測(cè)CD63的信號(hào)（B）。

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產(chǎn)品編號(hào)	產(chǎn)品名稱(chēng)	規(guī)格	包裝
058-09261	EV-Save™ Extracellular Vesicle Blocking Reagent EV-Save™ 細(xì)胞外囊泡吸附抑制劑	研究用	1mL

在進(jìn)行外泌體的熒光標(biāo)記法和細(xì)胞吸收外泌體的確認(rèn)時(shí)應(yīng)該注意的兩點(diǎn)是，外泌體具有的吸附特性與收量低下密切相關(guān)，現(xiàn)在市面上銷(xiāo)售的熒光標(biāo)記試劑不是以外泌體染色為目的而開(kāi)發(fā)的，對(duì)外泌體的特異性較低。對(duì)于如何配制高純度的外泌體樣品，本文提出了分離、提取方法的重要性。但是至今為止，如多數(shù)論文報(bào)告主要采用的那樣，分離、提取含有外泌體的細(xì)胞外囊泡的方法的黃金標(biāo)準(zhǔn)仍然是超離法，但實(shí)際上，超離法配制出的外泌體樣品會(huì)混入很多非細(xì)胞外囊泡來(lái)源的雜質(zhì)蛋白，我們?nèi)栽诶^續(xù)徹底評(píng)估污染物對(duì)下游實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。International Society for Extracellular Vesicles的雜志《Journal of Extracellular Vesicles》也提到過(guò)這個(gè)問(wèn)題4）。以FUJIFILM Wako開(kāi)發(fā)的"PS親和法"為基礎(chǔ)的MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS還有待改善，但它比超離法和各種分離、提取試劑盒能相比，能更簡(jiǎn)便地提取高濃度的外泌體。衷心希望在未來(lái)FUJIFILM Wako的產(chǎn)品能有助于以外泌體為代表的細(xì)胞外囊泡研究的進(jìn)一步發(fā)展。

1） Tkach, M. et al . : Cell , 164, 1226（2016）.
2） Nakai, W. et al . : Sci. Rep ., 6, 33935（2016）.
3） Saito, S. et al . : Sci. Rep ., 8, 3997（2018）.
4） Gardiner C. et al . : J. Extracell. Vesicles , 5, 32945（2016）

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