檢測PI 3-激酶活性的試劑盒

僅用于體外實驗，質(zhì)量保證12個月。在-20℃下儲存，避免反復(fù)冷凍/復(fù)溶 

試劑盒組成

2×反應(yīng)緩沖液（2×1.5ml）
1mM ATP（400ul）
脂類底物（8管）                                                        
對照PI 3-激酶（5ug）

您需要提供以下試劑和耗材

(γ³²P)-ATP
1M HCL
三氯甲烷/甲醇 1:1
2M乙酸/異丙醇 1:2
硅膠TLC平板
閃爍計數(shù)器

描述
PI 3-激酶分析試劑盒為高靈敏和定量檢測PI 3-激酶活性或篩選PI 3-激酶抑制劑提供了高效且操作簡單的工具。

PI3-激酶活性由放射性標(biāo)記(γ³²P)-ATP的量來進(jìn)行評估；底物隨后使用薄層色譜分離出來，且它的放射性在閃爍計數(shù)器中進(jìn)行檢測

背景

磷脂酰肌醇三激酶（PI3Ks）是一家族的酶，在細(xì)胞調(diào)節(jié)機制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。PI3Ks可以磷酸化磷酸肌醇(PIs)的3’-OH位置產(chǎn)生油脂二級信號。此功能可與許多生化反應(yīng)聯(lián)系，比如細(xì)胞生長，細(xì)胞分離，細(xì)胞生存，細(xì)胞增殖和遷移?；诮Y(jié)構(gòu)相似性和底物專一性，PI3K家族可以分為I,II和III三個級別。

所有的人Class I由催化亞族（分子量大約：110kDa）和非催化亞族（分子量50,55,85,87或101KDa）組成。他們是磷酸肌醇（PI），磷酯酰肌醇-4-單-磷酸(PIP)和磷脂酰肌醇-4，5-雙磷酸（PIP2)。

制備(γ³²P)-ATP混合液

制備ATP和(γ³²P)-ATP混合液，濃度為240uM.每次分析需要10ul的(γ³²P)-ATP混合液

制備脂質(zhì)底物

每一脂質(zhì)底物瓶中包含一定量的PI，可以分析12次，在瓶中裝滿脂質(zhì)底物和125ul的水，充分搖勻。
在超聲水浴鍋中超聲1h

激酶分析

按照下面的配方制備激酶分析混合液
反應(yīng)緩沖液：25ul
脂質(zhì)底物：10ul
酌情稀釋的PI 3激酶樣品：5ul
室溫下孵育5分鐘
加入10ul的(γ³²P)-ATP混合液啟動反應(yīng)
37℃環(huán)境下培養(yǎng)15分鐘
加入100ul HCL（1M）終止反應(yīng)并搖勻

萃取油脂

加入三氯甲烷/甲醇1:1 300ul
漩渦混合混合液，離心1分鐘，分離兩相
去除上層水相
用400ul HCL（1M）清洗有機相，去除水相

定量

將100ul的有機相轉(zhuǎn)移到硅膠TLC平板中，在2M的乙酸/異丙醇（1:2）中運行
暴露平板，進(jìn)行觀察；PI 3-激酶放在閃爍計數(shù)器中進(jìn)行定量
100ul的清洗過的三氯甲烷相可以通過液體閃爍器進(jìn)行計數(shù)

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