微囊藻毒素介紹

一、概述

隨著社會工業化進程的加快，人類在工農業生產及日常生活中，向水體排入大量含氮、磷的污染物，加速了湖泊的富營養化(Eutrophication)，藻類(Algae)由此而獲取豐富的營養而大量繁殖。有的調查表明，亞太地區54%的湖泊富營養化，歐洲、非洲、北美洲和南美洲的比例分別是53%，28%，48%和41%，我國則是60%。

在富營養化的淡水水體中，當有適宜的化學物理條件時，水體中的藻類短時間內大量繁殖并聚集的生態異?，F象稱為水華（Water Blooms, 也稱湖靛）；這一現象若發生在海洋里則通常稱為赤潮（Red Tide）。淡水水體富營養化危害很大的一個表征是水華的出現，每年夏、秋季節，在一些淡水湖泊均會形成大量水華，致使水質日趨惡化。

當水華出現時，水面被厚厚的藍綠色湖靛所覆蓋，甚至在岸邊大量堆積。在藻體大量死亡分解的過程中，不但散發惡臭，破壞景觀；同時大量消耗水中溶解氧，使魚類窒息死亡；尤其是藻類能釋放生物毒素——藻毒素(Algae Toxins)，這些類次級代謝產物嚴重危害人類和其他生物的安全。隨著富營養化的加劇，藻類水華發生的頻率和幅度也增加，有毒水華對水環境的危害和生物安全更日益引起廣泛的關注。

淡水中藍綠藻屬(Cyanobacteria，Blue-green Algae)分泌產生的藍藻毒素是目前已經發現的污染范圍廣，研究多的一類藻毒素。其中的微囊藻毒素LR (Microcystin-LR)是目前已知的毒性強的、急性危害很大的一種淡水藍藻毒素。

由于未及時地檢測水質情況的污染變化及采取相應的控制措施，致使這些毒素富集于魚類或貝類中并通過食物鏈傳遞，直接存在于飲用水或娛樂用水中，嚴重威脅人類的健康，全球已經發生了多起有關藻毒素中毒并引起死亡的事故。近年來淡水藻類污染已成為一個全球性的環境問題。

目前，為了保障人民的身體健康，我國現頒布執行的生活飲用水水質衛生規范（2001，0.001mg/L）和地表水環境質量標準（GB3838-2002。微囊藻毒素-LR，0.001mg/L）都包含了微囊藻毒素的檢測項目；世界衛生組織(WHO)在其推薦的飲用水標準指導（第二版）中也增加了微囊藻毒素（MC-LR, 1ug/L）等指標（WHO. 1998），其中都有關于微囊藻毒素LR的檢測。

目前對水體中藻毒素的檢測技術研究還比較落后。大多數藻毒素使用價格昂貴、體積龐大的HPLC-MS或GC-MS檢測，樣品制備過程復雜、耗時長，需要專業技術人員操作，檢測費用很高。因此限制了常規監測次數。近年來，美國、德國和日本等國家的科學家運用免疫技術結合計算機、傳感器技術，研究水中藻毒素（尤其是微囊藻毒素-LR）的原位免疫檢測方法。通過對居民生活飲用水水質的監測，為居民的身體健康提供保障，為控制和去除水體中的藻毒素提供幫助。

二、微囊藻毒素的分子結構

微囊藻毒素是一組環狀七肽，一般結構為：
環(-D-Ala-L-X-D-Masp-L-Z-Adda-D-Glu-Mdha)

其中：L為左旋；D為右旋。
Masp(有時寫作MeAsp)為Ｄ-赤-β-甲基天冬氨酸；
Adda為(2s,3s,8s,9s)-3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基-4,6-二烯酸；
Mdha為Ｎ-甲基脫氫丙氨酸。
X和Z為兩種可變的L-氨基酸，目前已發現下列三種XZ組合的藻毒素毒性較大：LR、RR和YR，其中L、R、Y分別代表Leu(亮氨酸)、Arg(精氨酸)和Tyr(酪氨酸)。2、4位氨基酸也是微囊藻毒素命名的依據。

構成環狀七肽的七個氨基酸，其中5個是非蛋白質氨基酸，2個(2、4點位)是蛋白質氨基酸。由于XZ的不同及Masp和Adda的甲基化或去甲基化產生的差異，可以形成多種不同的微囊藻毒素異構體。目前已從不同微囊藻菌株中分離、鑒定了60多種微囊藻毒素結構。目前已知存在的普遍、含量相對較多，毒性較大的是主要是MC-LR，MC-RR，MC-YR等數種，這幾種也是可商品購買的。

三、物理和生化性質

藻毒素具有水溶性和耐熱性。易溶于水，甲醇或丙酮，不揮發，抗pH變化。MC-LR的分子式為C₄₉H₇₄N₁₀O₁₂，分子量為995.2（計算時往往按1000計）。

其在水中的溶解性大于1ｇ/Ｌ，化學性質相當穩定。在水中藻毒素自然降解過程是十分緩慢的，當水中的含量為5ug/Ｌ時，三天后，僅10%被水體中微粒吸收，7%隨沙沉淀。藻毒素有很高的耐熱性，加熱煮沸都不能將毒素破壞，也不能將其去除；自來水處理工藝的混凝沉淀、過濾、加氯也不能將其去除。有調查試驗研究表明在某湖周圍3個自來水廠的出廠水中檢出低濃度的藻毒素(128～1400ng/L)，結果提示采用常規的飲水消毒處理不能徹底消除水體中的藻毒素。

它是一種肝毒素，這種毒素是肝癌的強烈促癌劑。

家畜及野生動物飲用了含藻毒素的水后，會出現腹瀉、乏力、厭食、嘔吐、嗜睡、口眼分泌物增多等癥狀，甚至死亡。病理病變有肝臟腫大、充血或壞死，腸炎出血、肺水腫等。

對于人類健康，微囊藻毒素也具有很大危害性。其中MC-LR的半致死劑量（LD50）約為50~100 ug/kg。人們在洗澡、游泳及其他水上休閑和運動時，皮膚接觸含藻毒素水體可引起敏感部位(如眼睛)和皮膚過敏；少量喝入可引起急性腸胃炎；長期飲用則可能引發肝癌。醫學部門已發現飲水中微量微囊藻毒素與人群中原發性肝癌的發病率有很大相關性。1996年在巴西造成100多名急性肝功能故障，7個月內至少50人死于藻毒素產生的急性效應，引起舉世矚目的關注。淡水水體中的藍藻毒素已成為全球性的環境問題，世界各地經常發生藍藻毒素中毒事件。

四、微囊藻毒素的危險評價及控制標準

既然水體中的藍藻毒素對人類具有潛在的危害，就有必要對水體中的藍藻毒素進行危險評價。

目前尚沒有強制性的飲水中藻毒素含量衛生標準，各國已有飲水中的藻毒素含量標準一般都為微囊藻毒素-LR的含量。世界衛生組織(WHO)推薦的飲水中的藻毒素標準為1.0ug/Ｌ，加拿大健康組織規定飲水中可接受的藻毒素標準為0.5ug/Ｌ（Guidelines for Canadian Drinking Water Quality, 1993），澳大利亞學者建議1μｇ/Ｌ的含量為安全飲用水的上限。我國尚未制定飲水中微囊藻毒素含量標準，在即將頒布的生活飲用水衛生規范中已將微囊藻毒素-LR的標準值列入，參照WHO標準，定為0.001ｍｇ/Ｌ。

根據表1的數據，我們可以推測，那些飲用未經處理的地表水的人群有攝入藍藻毒素的危險，特別是在藍藻水華發生的高峰季節。由此，可以看出藍藻毒素對發展中國家，特別是農村地區的人群比發達國家的人群具有更高的危險。但是，飲用經處理的地表水的人群并非就沒有攝入藍藻毒素的危險了，因為目前傳統的水處理方法在去除藍藻毒素方面效果并不好。無論對哪一類人群，兒童和嬰兒均比成人具有更高的攝入藍藻毒素的危險。

表1　飲用水中藍藻毒素的允許含量　μg·L-1

1)嬰兒、兒童和成人的體重分別按5、10、60kg計，每日飲水量分別按0.75、1、2Ｌ計；
2)由口服給藥所得結果；

五、微囊藻毒素的檢測方法

現在對水體中微囊藻毒素的檢測已發展了多種分析方法，主要有生物分析法、化學分析法和生化分析法。

5.1 生物分析法

傳統的生物分析法通常用小鼠腹腔注射或口腔灌喂評價微囊藻毒素的毒性。

用純化的微囊藻毒素或水華藍藻中粗提藻毒素進行測試，根據其生理病變及半致死量可初步確定其毒性(除個別異構體的LD₅₀為200～250μg/kg，多數微囊藻毒素的LD₅₀為60～70ug/kg)。這也是毒理評價的常用方法。此外還有用無脊椎動物如蝦、貝、水蚤及其卵進行毒性評價的研究，以細菌進行生物分析也有報道。這類方法靈敏度較差，所得到的毒型結果與小鼠的品系有關，可比性較差，且無法確定毒素類型及結構。但該方法操作簡單，且可以監測到過去未曾發現的新毒素。

5.2 化學分析法

化學分析法主要包括氣相色譜 (GC)、薄層色譜(TLC)、高效液相色譜(HPLC)、液相色譜/質譜分析(LC/MS)及毛細管電泳(CE)等，其中HPLC應用廣。這些方法利用微囊藻毒素的物化性質結合靈敏的光電技術對其進行定性、定量分析。

（一）、高效液相色譜(HPLC)

液相色譜可以分析一些氣相色譜無法分析的揮發性差、極性強、熱穩定性差的物質。常用的檢測器有紫外-可見光（UV-VIS）(ultraviolet- visible)檢測器、示差折光檢測器、熒光、化學發光檢測器、火焰離子化檢測器和電化學檢測器等。

HPLC>技術一般采用正相或反相色譜柱對毒素進行分離，然后進行紫外、熒光或化學發光(CL)檢測。將被測毒素與標準毒素的滯留時間進行比較可對被測毒素進行鑒定，將被測毒素與標準毒素的峰面積進行比較可對其進行精確定量。目前常采用HPLMC進行監測，監測限度一般為ng級。

高效液相色譜是目前應用、研究較多的方法，這一方面取決于微囊藻毒素本身的物理和化學性質，另一方面也因為該法有良好的靈敏度(可達0.1μｇ/Ｌ)和選擇性。其步驟是先將水華藍藻的毒素提取液或實際水樣通過固相萃取吸附富集，溶劑淋洗后將凈化的微囊藻毒素洗脫，用于定性分析。用于色譜分析。同時，可利用液相色譜的特點，與質譜或核磁共振聯用確定其分子式和結構。

（二）、LC/MS

HPLC監測技術往往需要標準毒素，而目前已發現60多種MC，多數缺乏標準毒素，這限制了HPLC的進一步應用。LC/MS技術很好地解決了這一問題，即使沒有標準毒素，只要知道這種毒素的分子量，就可對其進行定性，而且LC/MS技術亦可對毒素進行精確定量。快速原子轟擊質譜(FABMS)和液相次級離子質譜(LSIMS)是確定毒素分子量的有效手段。

（三）、氣相色譜法(GC)

氣相色譜法的一次進樣可以對多種物質混合樣品的各個組分進行定性、定量分析。氣相色譜法的優點是操作簡單、分離效能高、選擇性強、分析速度快。局限性主要表現在如果沒有標準樣品對照，就無法定性分離組分。用于氣相色譜法的檢測器多達十幾種，如電子捕捉檢測器、氫火焰離子化檢測器、堿離子化檢測器等。其中電子捕捉檢測器只對具有電負性的物質（鹵素、硝基、氧原子等化合物）有響應，而且選擇性強、靈敏度高，廣泛應用于有機氯農藥和其它含有電負性原子的農藥殘留檢測。

氣相色譜-質譜聯用GC-MS）技術已經比較成熟，結合了氣相色譜分離特性強和質譜儀良好的定性能力，使分離、定量和定性同時進行。但是它的局限性在于只適合于分析可以氣化的樣品。目前高分辨氣相色HRGC-HRMS）（High Respective）技術可以檢測到單位體積內幾個fg的量。如此高的檢測靈敏度也會帶來一些問題，因為樣品可能很快會被接觸到的玻璃容器、試劑甚至是實驗室的空氣所污染。

GC和GC/MS可用于MC總量的測定。

近期又發展了毛細電泳(CE)法。后者分析速度快、具有柱上富集功能并應用激光誘導熒光(laser-induced fluorescence, LIF)檢測器提高靈敏度。此外，同生化檢測法相比，CE易于實現自動化，避免了放射性物質。TLC也是有效的毒素監測手段，易于操作，不需特殊設備，監測限度可達ng級，但在監測的靈敏度方面要遜色于HPLC。

5.3 細胞毒性檢測技術

細胞毒性檢測技術是利用毒素對細胞的毒性作用來監測毒素的一種技術，不僅可以判斷毒素存在與否，而且可以對毒素進行精確的定量。這種方法監測的也是能發揮相同毒性作用的毒素的總量。

Fladmark等建立了一種根據MC導致鮭魚或大鼠肝細胞凋亡的程度來確定MC的方法。他們將分離的鮭魚或大鼠的肝細胞懸浮培養，然后加入MC，根據細胞凋亡的程度即可求出MC的含量，監測限度為10～20ng。

動物細胞凋亡的第一個信號是發生凋亡的細胞與鄰近的細胞分離。根據這一特性，Fladmark等還建立了用MC導致懸浮培養的鮭魚或大鼠肝細胞解聚的程度來監測毒素的方法，所得結果比用判斷細胞凋亡的程度所得結果靈敏5～10倍。

5.4 酶活性抑制檢測技術

由于MC等能夠抑制PP1和PP2A的活性，因此可以通過對酶活性的抑制程度來監測這幾種毒素。自Holmes等提出蛋白磷酸酶抑制檢測(protein phosphatase inhibition assay, PPIA)技術以來，這種技術得到了迅速發展。PPIA多數以³²P標記的糖原磷酸化酶a為底物。由于糖原磷酸化酶a只能被PP1和PP2A水解，而PP1和PP2A又可被MC等抑制，因此在MC、PP和糖原磷酸化酶反應后根據PP水解糖原磷酸化酶a釋放出³²P的量就可計算出毒素的量。一般用不同濃度的標準毒素MC-LR作標準曲線，用MC-LR的量來代表總毒素的量。隨著對硝基苯酚磷酸酯(pNPP)可被PP水解現象的發現，人們建立了一種以pNPP為底物的磷酸酶抑制比色監測技術，根據pNPP被水解后產生的有色產物的多少來確定毒素的量。PPIA的監測限度為pg級，它監測的是能抑制PP的總毒素的量，而不是某一種毒素的量。但藍藻本身具有的內源蛋白磷酸酶活性有可能使PPIA的結果偏低。

5.5 免疫檢測

毒素的免疫監測技術的原理是利用毒素誘發免疫反應產生抗體，利用抗體對抗原的特異性識別來對各種毒素進行監測。

較早的免疫檢測是免疫化學技術中有效的一種分析方法，1960年由Yalow和Berson開創的，用于檢測血液中的胰島素。從此，免疫檢測廣泛應用于醫藥化學分析領域，檢測激素、藥品、病毒等。免疫檢測操作非常簡單，但是在環境污染物檢測分析中的實際應用卻非常少。

免疫檢測的基礎是抗原抗體之間的反應。它是以一種抗體或多種抗體作為分析試劑，對待測物進行定量或定性分析的檢測方法。抗體是一種免疫球蛋白，它是動物機體對外來物質（抗原）發生反應而產生的?？贵w可以和抗原物質形成抗原-抗體復合物。在免疫化學分析方法中，未反應的抗原和抗體被稱作自由相，抗原- 抗體復合物被稱作結合相?？乖涂贵w之間的反應具有特異性，并且非常靈敏。這些特性對于動物機體防御疾病和免疫檢測都非常重要。隨著樣品檢測費用的不斷提高和檢測項目的不斷增加，發展了免疫化學檢測方法；另一方面，對快速、簡單的原位檢測的需求，也促進了免疫檢測的發展。免疫檢測可以廣泛地用于檢測許多不同的化合物。

自80年代開始，酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)開始用于MC的監測。水質免疫檢測中常用的檢測方法是競爭性非勻相酶聯免疫檢測。在這個檢測方法通常將抗體包被在96孔板（聚苯乙烯微量滴定板）的微孔底部，或者其他固定相上。把酶標記在已知濃度半抗原上，以便產生可以檢測的信號。在待測半抗原和已知濃度的酶標記和抗體形成復合物之后，將剩余的試劑洗脫，加入酶的底物，產生顯色反應。根據顏色的深淺，定量抗原，或者根據是否顯色，判別樣品中是否有分析物存在。

Chu等人首先提出了應用ELISA監測MC的完整程序，他們將MC-LR與牛血清蛋白偶聯，用得到的偶聯物免疫兔制備兔抗MC-LR多克隆抗體(PAb)，然后將MC-LR與辣根過氧化物酶偶聯，以鄰苯二胺(OPD)為底物用直接競爭法做ELISA。用不同濃度的標準毒素MC-LR作標準曲線，根據底物的顯色程度與標準曲線作比較即可求出毒素的含量，監測限度為0.20μg/L。他們發現抗MC-LR PAb與MC-LR，-RR，-YR有較好的交叉反應性，但與MC-LY，-LA的交叉反應性低。An和Carmichael證實了Chu等的觀點，并提出C-6上為E-型的Adda和Arg對毒素的抗原性是必需的。McDermott等用從雞蛋黃中提取的抗MC-LR PAb做ELISA監測毒素，發現監測限度為95ng/L。這種方法制備的抗體產量大，方法簡便，而且對MC-LR和-RR有良好的交叉反應性。盡管抗MC的單克隆抗體(MAb)很早就已制備，但直到1995年才由Nagata等建立起一整套完整的ELISA監測技術，其監測限度為25ng/L。近來，他們又制備了能夠特異性的識別抗MC-MAb和MC形成的免疫復合體(immune complex)但不與MC或抗MC MAb反應的單克隆抗體，并建立了一種三明治監測技術，監測限度為2ng/L。目前已有針對MC的ELISA試劑盒可以買到，這大大方便了毒素的監測工作。但目前的試驗表明抗體往往只是針對某一種毒素建立起來的，對某些毒素的交叉反應性低，不能監測所有的毒素。有研究表明，將分別針對某一種毒素做ELISA所得結果加起來后與用小鼠法所得結果有很好的一致性。

酶聯免疫法由于具有靈敏、快速、簡單、便攜、易用、適用現場分析等特點，顯示出良好的發展趨勢。

常規的理化檢測儀器，特別是液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS）和氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）儀器體積龐大、價格昂貴、需要環境條件較高的室內環境、而且還需要專門的技術人員操作，因此檢測費用居高不下（＄40-200/樣品）；磷酸酶抑制試驗和細胞試驗雖然都能很好地檢測出毒素，但是靈敏度太低，甚至不能有效地檢測出WHO推薦的1mg/L；同時，環境監測的項目、樣品數量不斷增多，檢測限不斷提高。免疫分析是基于抗原-抗體特異性反應的分析方法，檢測靈敏度高、特異性強、分析容量大、反應速度快、檢測費用低廉（＄5-10/樣品）。因此，免疫分析技術受到了各國的重視。美國、德國在80年代末開始研究免疫檢測方法，世界糧農組織（FAO）已經相許多國家推薦這項技術。因而開發和利用免疫檢測技術是有前景的，美國國家環保局（EPA）目前推行的幾種用于檢測環境中microcystins的方法按先后順序依次為：

• Immunoassay
• Bioassay
• Protein phosphatase assay
• HPLC
• LC/MS

由于微量藍藻毒素對人類危害嚴重，迫切需要對水體中特別是做為飲水水源的湖泊、河流和水庫中的藍藻毒素進行連續監測。上面提到的監測技術是針對分布廣、毒性大的微囊藻毒素建立的，這些監測技術各有其優點和缺點，對比如表2所示。

表2　微囊藻毒素監測技術的優缺點

HPLC：高效液相色譜；ELISA：免疫吸附測定；PPIA：蛋白磷酸酶抑制測定；PP：蛋白磷酸酶。

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