Cisbio HTRF技術磷酸化檢測整體解決方案

來源：作者：人氣：-發表時間：2019-06-26 13:28:00【大中小】

磷酸化和去磷酸化是細胞中酶的化學修飾調節中常見，也是重要的。很多酶需要磷酸化后才有活性，然后再進一步使它的下游磷酸化。Cisbio Bioassays 提供一系列HTRF磷酸化蛋白測量試劑，可以直接檢測細胞裂解液或完整細胞中的磷酸化蛋白的含量。該方法操作簡單、穩定可靠、靈敏度高，并且可以用很小體積的微孔板進行實驗，適合高通量篩選。HTRF 技術可用來進行第二信使檢測、胞內信號分子檢測和受體配體結合檢測方案，幫助您進行G蛋白偶聯受體的研究。

西寶生物提供的HTRF技術磷酸化檢測試劑盒和相關激酶，品種齊全，質量保證。訂購熱線：400-021-8158！

HTRF磷酸化檢測原理：

實驗可在細胞裂解液或者完整細胞中進行。當受體被刺激后，引發了相關激酶的活化，導致下游蛋白被磷酸化。細胞膜裂解之后，磷酸化的蛋白釋放出來，被HTRF試劑檢測到。磷酸化蛋白的測量應用了雙抗體夾心法，兩個抗體均為單克隆抗體。其中一個為抗磷酸化蛋白的抗體，標記Eu；另一個為抗蛋白其它位點的抗體，標記d2，見圖1。這些抗體可以預先混合后，通過一次加樣來完成。所有的實驗均可通過兩步法或者一步法實現。

圖1：HTRF磷酸化蛋白測量的實驗過程

一步法：

細胞鋪板，化合物刺激，細胞裂解和磷酸化蛋白檢測均在同一個板孔中，不需要洗滌過程。此方法更加適用于高通量篩選，并且在不影響HTRF優越性的前提下減少了試劑用量。

兩步法：

細胞置于培養板中，化合物刺激后裂解細胞。將裂解液轉移到檢測板中，加入HTRF檢測試劑檢測磷酸化蛋白該方法可以觀察細胞的存活和生長情況。

目前已經上市的HTRF磷酸化檢測試劑盒有：

pERK	pP38	pSTAT3
pAKT	pATF2	pSTAT5
pBAD	pS6RP/pMEK1	pSTAT6

下面我們重點來看一下這款pERK磷酸化檢測試劑盒

Cellul´erk 胞外調節蛋白激酶磷酸化檢測試劑盒 --- 直接測量細胞水平實驗中磷酸化ERK1/2的含量

ERK1/2是許多信號傳導通路的會聚點，所以可以用磷酸化ERK含量的變化來反應G蛋白偶聯受體是否被活化或者抑制。

磷酸化ERK1/2檢測是基于雙抗體夾心法的原理。在試劑盒中含有兩個抗體，一個抗體是抗磷酸化ERK1/2的抗體，標記d2；另一個抗體是抗ERK1/2其它位點的抗體，標記Eu。

檢測原理：

受體受到刺激，ERK1/2被磷酸化。在細胞膜裂解之后，磷酸化的ERK1/2釋放出來，通過基于HTRF技術的雙抗體夾心法被檢測到。其中

試劑盒應用HTRF技術，不需要洗滌，比Western Blot、 ELISA和其它基于微珠測試的方法更加簡單快速。

磷酸化檢測原理圖

HTRF磷酸化檢測案例：

案例一：Gαq/i偶聯的受體活化

Rantes 和 MIP-Ib在室溫條件下刺激CCR5受體（CHO，25,000細胞/孔），時間為10分鐘，用HTRF Cellul´ERK 試劑盒來測試磷酸化ERK1/2水平。EC50分別為2.8 nM和18.8 nM，與文獻報道一致。

CHO-CCR5中ERK1/2的磷酸化水平

案例二：用Cellul´erk進行篩選具有很好的穩定性

用Carbachol （卡巴膽堿）在室溫刺激CHO-M1細胞，時間為10分鐘（5,000細胞/孔，384淺孔板），結果如下圖

選擇未刺激的細胞、1.3 μM Carbochol和4 μM Carbochol計算Z´值，分別對應實驗的基礎水平、EC80和EC100，每種條件50個重復，實驗采用一步法。兩個條件的Z´值均大于0.7，表明實驗穩定，可用于高通量篩選。

案例三：MAPK信號通路的活化

用PMA刺激CHO-M1細胞（50,000細胞/孔），時間為10分鐘，結果如圖

PMA是PKC的直接激活劑。該實驗得到的EC50為9.6 nM，檢測窗口為4.5。

PMA刺激的CHO-M1細胞中ERK1/2的磷酸化水平

產品訂購信息：

產品描述	規格	產品貨號	品牌	儲存條件
ERK phospho-T202/Y204 kit	500tests	64ERKPEG	Cisbio	2-8°C
ERK phospho-T202/Y204 kit	10,000tests	64ERKPEH	Cisbio	2-8°C
ERK phospho-T202/Y204 kit control lysate	kit	62ERKTDA	Cisbio	2-8°C
Advanced ERK phospho- T202 /Y204 kit	500tests	64AERPEG	Cisbio	-60℃以下
	1x96tests	64AERPET	Cisbio	-60°C以下
	10,000tests	64AERPEH	Cisbio	-60℃以下
Advanced ERK phospho- T202 /Y204 kit control lysate	kit	64AERTDA	Cisbio	2-8°C
Phospho and Total protein blocking reagent	2ml	64KB1AAC	Cisbio	2-8°C
Phospho and Total protein blocking reagent	6ml	64KB1AAD	Cisbio	2-8°C
Phospho-Total protein lysis buffer	130ml	64KL1FDF	Cisbio	2-8°C