Cisbio HTRF技術(shù)磷酸化檢測整體解決方案

來源：作者：人氣：-發(fā)表時(shí)間：2019-06-26 13:28:00【大中小】

磷酸化和去磷酸化是細(xì)胞中酶的化學(xué)修飾調(diào)節(jié)中常見，也是重要的。很多酶需要磷酸化后才有活性，然后再進(jìn)一步使它的下游磷酸化。Cisbio Bioassays 提供一系列HTRF磷酸化蛋白測量試劑，可以直接檢測細(xì)胞裂解液或完整細(xì)胞中的磷酸化蛋白的含量。該方法操作簡單、穩(wěn)定可靠、靈敏度高，并且可以用很小體積的微孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，適合高通量篩選。HTRF 技術(shù)可用來進(jìn)行第二信使檢測、胞內(nèi)信號分子檢測和受體配體結(jié)合檢測方案，幫助您進(jìn)行G蛋白偶聯(lián)受體的研究。

西寶生物提供的HTRF技術(shù)磷酸化檢測試劑盒和相關(guān)激酶，品種齊全，質(zhì)量保證。訂購熱線：400-021-8158！

HTRF磷酸化檢測原理：

實(shí)驗(yàn)可在細(xì)胞裂解液或者完整細(xì)胞中進(jìn)行。當(dāng)受體被刺激后，引發(fā)了相關(guān)激酶的活化，導(dǎo)致下游蛋白被磷酸化。細(xì)胞膜裂解之后，磷酸化的蛋白釋放出來，被HTRF試劑檢測到。磷酸化蛋白的測量應(yīng)用了雙抗體夾心法，兩個(gè)抗體均為單克隆抗體。其中一個(gè)為抗磷酸化蛋白的抗體，標(biāo)記Eu；另一個(gè)為抗蛋白其它位點(diǎn)的抗體，標(biāo)記d2，見圖1。這些抗體可以預(yù)先混合后，通過一次加樣來完成。所有的實(shí)驗(yàn)均可通過兩步法或者一步法實(shí)現(xiàn)。

圖1：HTRF磷酸化蛋白測量的實(shí)驗(yàn)過程

一步法：

細(xì)胞鋪板，化合物刺激，細(xì)胞裂解和磷酸化蛋白檢測均在同一個(gè)板孔中，不需要洗滌過程。此方法更加適用于高通量篩選，并且在不影響HTRF優(yōu)越性的前提下減少了試劑用量。

兩步法：

細(xì)胞置于培養(yǎng)板中，化合物刺激后裂解細(xì)胞。將裂解液轉(zhuǎn)移到檢測板中，加入HTRF檢測試劑檢測磷酸化蛋白該方法可以觀察細(xì)胞的存活和生長情況。

目前已經(jīng)上市的HTRF磷酸化檢測試劑盒有：

pERK	pP38	pSTAT3
pAKT	pATF2	pSTAT5
pBAD	pS6RP/pMEK1	pSTAT6

下面我們重點(diǎn)來看一下這款pERK磷酸化檢測試劑盒

Cellul´erk 胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶磷酸化檢測試劑盒 --- 直接測量細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)中磷酸化ERK1/2的含量

ERK1/2是許多信號傳導(dǎo)通路的會聚點(diǎn)，所以可以用磷酸化ERK含量的變化來反應(yīng)G蛋白偶聯(lián)受體是否被活化或者抑制。

磷酸化ERK1/2檢測是基于雙抗體夾心法的原理。在試劑盒中含有兩個(gè)抗體，一個(gè)抗體是抗磷酸化ERK1/2的抗體，標(biāo)記d2；另一個(gè)抗體是抗ERK1/2其它位點(diǎn)的抗體，標(biāo)記Eu。

檢測原理：

受體受到刺激，ERK1/2被磷酸化。在細(xì)胞膜裂解之后，磷酸化的ERK1/2釋放出來，通過基于HTRF技術(shù)的雙抗體夾心法被檢測到。其中

試劑盒應(yīng)用HTRF技術(shù)，不需要洗滌，比Western Blot、 ELISA和其它基于微珠測試的方法更加簡單快速。

磷酸化檢測原理圖

HTRF磷酸化檢測案例：

案例一：Gαq/i偶聯(lián)的受體活化

Rantes 和 MIP-Ib在室溫條件下刺激CCR5受體（CHO，25,000細(xì)胞/孔），時(shí)間為10分鐘，用HTRF Cellul´ERK 試劑盒來測試磷酸化ERK1/2水平。EC50分別為2.8 nM和18.8 nM，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

CHO-CCR5中ERK1/2的磷酸化水平

案例二：用Cellul´erk進(jìn)行篩選具有很好的穩(wěn)定性

用Carbachol （卡巴膽堿）在室溫刺激CHO-M1細(xì)胞，時(shí)間為10分鐘（5,000細(xì)胞/孔，384淺孔板），結(jié)果如下圖

選擇未刺激的細(xì)胞、1.3 μM Carbochol和4 μM Carbochol計(jì)算Z´值，分別對應(yīng)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)水平、EC80和EC100，每種條件50個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)采用一步法。兩個(gè)條件的Z´值均大于0.7，表明實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定，可用于高通量篩選。

案例三：MAPK信號通路的活化

用PMA刺激CHO-M1細(xì)胞（50,000細(xì)胞/孔），時(shí)間為10分鐘，結(jié)果如圖

PMA是PKC的直接激活劑。該實(shí)驗(yàn)得到的EC50為9.6 nM，檢測窗口為4.5。

PMA刺激的CHO-M1細(xì)胞中ERK1/2的磷酸化水平

產(chǎn)品訂購信息：

產(chǎn)品描述	規(guī)格	產(chǎn)品貨號	品牌	儲存條件
ERK phospho-T202/Y204 kit	500tests	64ERKPEG	Cisbio	2-8°C
ERK phospho-T202/Y204 kit	10,000tests	64ERKPEH	Cisbio	2-8°C
ERK phospho-T202/Y204 kit control lysate	kit	62ERKTDA	Cisbio	2-8°C
Advanced ERK phospho- T202 /Y204 kit	500tests	64AERPEG	Cisbio	-60℃以下
	1x96tests	64AERPET	Cisbio	-60°C以下
	10,000tests	64AERPEH	Cisbio	-60℃以下
Advanced ERK phospho- T202 /Y204 kit control lysate	kit	64AERTDA	Cisbio	2-8°C
Phospho and Total protein blocking reagent	2ml	64KB1AAC	Cisbio	2-8°C
Phospho and Total protein blocking reagent	6ml	64KB1AAD	Cisbio	2-8°C
Phospho-Total protein lysis buffer	130ml	64KL1FDF	Cisbio	2-8°C

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