代替嗎啡治療疼痛的依賴！Science子刊：基于CRISPR和鋅指蛋白的基因治療技術緩解慢性疼痛

來源：生物探索作者：人氣：-發表時間：2021-03-23 10:07:00【大中小】

慢性疼痛是指持續一個月以上的疼痛，骨關節炎、頸痛、腰痛、頭痛、癌痛等均是常見的慢性疼痛。目前，我國至少有一億以上的慢性疼痛患者。由于它的發作給患者帶來的痛楚，會使人出現睡眠紊亂、缺乏食欲、精神崩潰等后果，這嚴重影響生活質量，因此也有人把慢性疼痛比喻為一種不死的癌癥。目前治療慢性疼痛的主要方法是服用阿片類藥物（如嗎啡、杜冷丁），但是阿片類藥物具有嚴重的不良反應，長期服用會導致耐受和依賴。

已有研究表明，電壓門控鈉離子通道（Nav）與疼痛感覺的發生相關，而且Nav1.7可能在慢性疼痛中起中心作用。因此葛蘭素史克（GSK）、輝瑞（Pfizer）、渤健（Biogen）和基因泰克（Genentech）等公司一直在嘗試使用小分子藥物和抗體來阻斷Nav1.7，但這些療法會與體內結構相似的其他鈉通道相互作用，產生麻木等不良的副作用，均未取得成功。

2021年3月10日，加利福尼亞大學圣地亞哥分校發表在《Science Translational Medicine》雜志上題為“Long-lasting analgesia via targeted in situ repression of NaV1.7 in mice”的研究，利用dCas9蛋白和鋅指蛋白靶向定位Nav1.7，阻止Nav1.7基因的表達，從而緩解小鼠慢性疼痛。

和鋅指蛋白靶向定位Nav1.7，阻止Nav1.7基因的表達，從而緩解小鼠慢性疼痛

為了開發一款持久且非成癮性緩解慢性疼痛的產品，研究人員探索了兩種獨立的遺傳學方法來抑制疼痛在脊柱水平的傳播。一種是使用dCas9蛋白（不會產生切割，只會在sgRNA的引導下特異性的結合目的位點）實現對NaV1.7的非永久性基因抑制。另一種是使用ZFP鋅指蛋白（識別并修飾特定DNA序列）進行表觀遺傳調控NaV1.7的表達。并將兩種蛋白包裝在腺相關病毒（AAV）中，穿梭進細胞中。

接下來，研究人員探究了在三種常見疼痛模型中兩種抑制NaV1.7表達方法的表現。

首先是卡拉膠誘發的炎性疼痛模型，在小鼠施加卡拉膠24小時后，提取DRG，并通過qPCR確定NaV1.7轉錄表達的抑制。結果發現，注射AAV9-Zinc-Finger-4-KRAB的小鼠NaV1.7抑制率達67％，注射AAV9-KRAB-dCas9-dual-gRNA的小鼠NaV1.7抑制率達50％，而且還觀察到注射AAV9-Zinc-Finger-4-KRAB和AAV9-KRAB-dCas9-dual-gRNA的小鼠中縮爪反應潛伏期（PWL）顯著增加。這說明小鼠NaV1.7的靶向抑制可以降低炎性疼痛狀態下的熱痛覺過敏。

第二種模型是化療法中紫杉醇產生的多發性神經性疼痛，在第14、16、18和20天對小鼠腹膜內給予8 mg / kg紫杉醇，然后測試小鼠的觸覺異常性疼痛閾值。結果發現對照組和AAV9-KRAB-dCas9-no-gRNA的小鼠的閾值降低，而AAV9-Zinc-Finger-4-KRAB和、AAV9-KRAB- dCas9-dual-gRNA的閾值增加。這表明原位抑制NaV1.7可預防化療引起的觸覺異常性疼痛。

第三種模型是BzATP（ATP類似物）誘導的持續性疼痛，在小鼠鞘內注射30 nmol BzATP后，測量0.5、1、2、3、6和24小時觸覺異常性疼痛閾值。結果發現注射、AAV9-KRAB-dCas9-dual-gRNA的小鼠中，在30分鐘、1小時和3小時的時間點，觸覺異常性疼痛明顯減少。這說明靶向抑制NaV1.7緩解BzATP誘導的持續性疼痛。

進一步為了確定NaV1.7原位抑制對慢性疼痛是否長期有效，研究人員在鞘內注射AAV后第42、84和308天重復了卡拉膠炎性疼痛模型并測試了熱痛覺過敏，觀察到在所有三個時間點，AAV9-Zinc-Finger-4-KRAB的小鼠PWL都有顯著改善，這說明NaV1.7原位抑制對炎癥性疼痛具有持久性。

研究人員在AAV注射后105天和最后一次紫杉醇注射后85天測量了小鼠異常性疼痛閾值。結果發現，與前期結果相比，對照組和AAV9-KRAB-dCas9-no-gRNA的小鼠在第105天時的觸覺異常性疼痛都比第21天增加了，而注射AAV9-Zinc-Finger-4-KRAB和AAV9-KRAB-dCas9-dual-gRNA的小鼠的閾值增加，這表明NaV1.7的原位阻遏對化療產生的疼痛具有長期預防的作用。

最后，為了確定通過ZFP-KRAB和KRAB-dCas9抑制NaV1.7表觀遺傳的潛在副作用，研究人員進行了一系列毒性和副作用測試，結果發現不會影響小鼠的體重、體溫和肌肉張力。并研究了鋅指蛋白和CRISPR-dCas9介導的基因沉默對轉錄調控的全基因組影響，確認了靶向基因調控的CRISPR和鋅指方法均具有高度特異性。

總的來說，這種療法在不關閉其他鈉通道的情況下敲低了Nav1.7的表達，小鼠除疼痛外沒有失去任何感覺，也沒有表現出其他副作用，這是研究慢性疼痛治療方法中又一里程碑式的發現。