基因編輯大牛張鋒利用基于CRISPR-Cas13的SHERLOCK系統(tǒng)檢測冠狀病毒COVID-19

來源：作者：人氣：-發(fā)表時間：2020-02-17 08:43:00【大中小】

最近的新型冠狀病毒（COVID-19，又稱為SARS-CoV-2，之前稱為2019-nCoV）疫情給全球健康帶來了巨大挑戰(zhàn)。為了應(yīng)對這一全球挑戰(zhàn)，美國布羅德研究所、麥戈文腦科學(xué)硏究所及其合作機構(gòu)致力于提供潛在有用的信息，包括分享可能能夠支持開發(fā)潛在診斷方法的信息。

作為采取的應(yīng)對措施的一部分，張鋒（Feng Zhang）、Omar Abudayyeh和Jonathan Gootenberg開發(fā)了適用于純化的RNA的研究方案，這可能有助于開發(fā)基于CRISPR的診斷方法來臨床檢測COVID-19。

這種初始的研究方案并不是診斷性的測試方法，而且尚未在患者樣本上進行測試。任何診斷方法都需要針對臨床用途進行開發(fā)和驗證，并且需要遵循所有當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)和最佳實踐。盡管如此，這種研究方案仍然為使用試紙條建立基于SHERLOCK的COVID-19診斷方法提供了基本框架。

針對COVID-19的SHERLOCK研究方案。

何為SHERLOCK系統(tǒng)？

2017年，張鋒等人將一種靶向RNA（而不是DNA）的CRISPR相關(guān)酶（即Cas13a）改造為一種快速的、廉價的和高度靈敏的診斷工具，即SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing）。這種技術(shù)可能有朝一日被用來應(yīng)對病毒性和細菌性流行病爆發(fā)、監(jiān)控抗生素耐藥性和檢測癌癥。相關(guān)研究結(jié)果于2017年4月13日在線發(fā)表在Science期刊上，論文標(biāo)題為“Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2”。

在這種技術(shù)中，不同于靶向DNA的CRISPR相關(guān)酶（如Cas9和Cpf1），Cas13a能夠在切割它的靶RNA之后保持活性，而且可能表現(xiàn)出不加區(qū)別的切割活性，而且在一系列被稱作“附帶切割（collateral cleavage）”的作用當(dāng)中，繼續(xù)切割其他的非靶RNA。它采用一種不同的依賴體溫的擴增過程來提高他們的測試樣品中的DNA或RNA水平。一旦這種水平增加，他們利用第二個擴增步驟將DNA轉(zhuǎn)化為RNA使得他們將這種靶向RNA 的CRISPR工具的靈敏度增加了一百萬倍，而且這種工具能夠在幾乎任何環(huán)境下使用。

另外，這種CRISPR工具還包括一種RNA報告分子。當(dāng)該報告分子被切割時，它會發(fā)出熒光。當(dāng)Cas13a檢測到靶RNA序列時，它的無區(qū)分的RNA酶活性（即附帶切割活性）也會切割這種RNA報告分子，從而釋放可檢測到的熒光信號。

2018年，布羅德研究所核心成員Feng Zhang 教授和他的團隊對SHERLOCK診斷平臺進行一系列優(yōu)化，開發(fā)出一種微型試紙條測試方法，在將試紙條浸入經(jīng)過處理的樣品中后，就會出現(xiàn)一條線來指示靶分子是否被檢測到，從而允許用肉眼觀察到測試結(jié)果，而無需使用昂貴的設(shè)備。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2018年4月27日的Science期刊上，論文標(biāo)題為“Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6”。

他們讓這種平臺使用來自不同細菌種類的Cas13和Cas12a（以前稱為Cpf1）酶來產(chǎn)生額外的信號。此外，他們還添加了一種額外的CRISPR相關(guān)酶（即Csm6）來放大檢測信號，從而增加了SHERLOCK的靈敏度，并增加準(zhǔn)確地定量確定樣品中的靶分子水平和一次測試多種靶分子的能力。

針對COVID-19的SHERLOCK實驗方案

這種基于CRISPR-Cas13的SHERLOCK系統(tǒng)先前已顯示出可以準(zhǔn)確地檢測患者樣本中多種不同病毒的存在。這種SHERLOCK系統(tǒng)搜索獨特的核酸序列并使用類似于妊娠測試條的試紙條提供視覺讀數(shù)。將試紙條浸入準(zhǔn)備好的樣本中后，在它的表面上會出現(xiàn)一條線，指示待測病毒是否存在。

這些研究人員通過使用合成的COVID-19 RNA片段，設(shè)計并測試了兩種向?qū)NA（gRNA），每種gRNA特異性地識別COVID-19的一種特征性的核酸片段。當(dāng)與Cas13蛋白結(jié)合時，它們形成了一種能夠檢測COVID-19病毒RNA是否存在的SHERLOCK系統(tǒng)。

這個研究方案包括三個步驟。它可以用于測試當(dāng)前從臨床樣本中提取的用于定量PCR（qPCR）測試的RNA：

步驟1：將提取出的RNA在42℃下等溫擴增反應(yīng)25分鐘；

步驟2：讓步驟1中的擴增產(chǎn)物與Cas13蛋白、gRNA和報告分子在37℃下孵育30分鐘；

步驟3：將試紙條浸入步驟2中的反應(yīng)產(chǎn)物溶液中，結(jié)果應(yīng)當(dāng)在5分鐘內(nèi)出現(xiàn)。

這種研究方案的詳細細節(jié)可參照參考文獻1。隨著這些研究人員繼續(xù)與世界各地尋求應(yīng)對這次疫情的研究人員獨立地開展實驗和合作開展實驗，對這種研究方案的更新將會不斷進行。

下一步是什么

SHERLOCK診斷系統(tǒng)已在其他條件下中取得了成功。這些研究人員希望這種研究方案是朝著構(gòu)建一種利用簡單的讀數(shù)檢測患者樣本中COVID-19是否存在的SHERLOCK系統(tǒng)邁出的有用的一步。進一步的優(yōu)化、生產(chǎn)、測試和驗證仍然是需要的。任何診斷方法都必須遵循所有當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)、最佳實踐和進行驗證后，才能真正用于臨床。這些研究人員將繼續(xù)發(fā)布和分享研究方案更新，并歡迎來自科學(xué)界的更新。

參考資料：

1.A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics https://broad.io/sherlockprotocol

2.Enabling coronavirus detection using CRISPR-Cas13: An open-access SHERLOCK research protocol https://www.broadinstitute.org/news/enabling-coronavirus-detection-using-crispr-cas13-open-access-sherlock-research-protocol

3.Jonathan S. Gootenberg et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 13 Apr 2017, doi:10.1126/science.aam9321.

4.Jonathan S. Gootenberg et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science, Published online: 15 Feb 2018, doi:10.1126/science.aaq0179