內(nèi)毒素檢測(cè)知多少（上篇）

來(lái)源：作者：人氣：-發(fā)表時(shí)間：2019-10-28 14:08:00【大中小】

內(nèi)毒素（endotoxin）是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，叫做脂多糖。脂多糖對(duì)宿主是有毒性的。內(nèi)毒素只有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細(xì)胞后才釋放出來(lái)，所以叫做內(nèi)毒素。

腸道桿菌多為革蘭氏陰性桿菌，具有內(nèi)毒素，若引起敗血癥、腦膜炎等感染時(shí)，可用血液、腦脊液及體液等檢測(cè)內(nèi)毒素，以協(xié)助臨床診斷。另外，在生產(chǎn)藥劑等過(guò)程中，自然環(huán)境中產(chǎn)生內(nèi)毒素的細(xì)菌也常污染注射制劑、生物制品等，出廠前也要嚴(yán)格檢查。內(nèi)毒素的檢測(cè)在現(xiàn)代臨床生物技術(shù)中越發(fā)顯得重要，西寶生物作為Wako的一級(jí)代理商致力于生命科學(xué)領(lǐng)域十多年，可為廣大客戶提供內(nèi)毒素檢測(cè)的整體解決方案，從儀器設(shè)備和相關(guān)試劑和耗材等

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【什么是內(nèi)毒素】

內(nèi)毒素一種在革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的脂多糖（LPS）。它是一種典型的熱原，哪怕是皮克級(jí)（10^-12g）或納克級(jí)的（10^-9g）內(nèi)毒素進(jìn)入血液，也會(huì)引發(fā)各種生物反應(yīng)。因?yàn)槠溆兄蜔嵝院头€(wěn)定性，通過(guò)高壓蒸汽處理也不能完全使內(nèi)毒素滅活，需在250℃或以上的溫度下，干熱處理至少半小時(shí)才能使其滅活。它存在于革蘭氏陰性菌棲息的環(huán)境中（例如水，空氣），即使在細(xì)菌死亡后，細(xì)菌性的內(nèi)毒素（LPS）仍然存在。

圖1. 脂多糖（LPS）結(jié)構(gòu)示意圖

圖1為脂多糖的結(jié)構(gòu)圖如圖所示，脂質(zhì)A在該物質(zhì)中是負(fù)責(zé)生物活性的主要部分，這部分的分子量約為2000。包含糖鏈部分在內(nèi)的整個(gè)分子的分子量一般為5000到8000左右。然而，因?yàn)閮?nèi)毒素是一種同時(shí)擁有親水區(qū)（糖鏈）和疏水區(qū)（脂質(zhì)A）的分子，它能在水溶液中相互締合，形成表觀分子量為數(shù)十至數(shù)百萬(wàn)的膠束結(jié)構(gòu)。有報(bào)告指出，膠束結(jié)構(gòu)的變化，會(huì)影響其生物活性的強(qiáng)弱。

圖2. 脂質(zhì)A的結(jié)構(gòu)（大腸桿菌型和沙門氏菌型）

圖2所示為大腸桿菌型和沙門氏菌型的脂質(zhì)A的結(jié)構(gòu)。從圖中能看出即使菌株不一樣，脂質(zhì)A的基本結(jié)構(gòu)在大體上仍然相同。

【使用鰲阿米巴樣細(xì)胞溶解物（LAL）試劑的各種內(nèi)毒素檢測(cè)方法】

由馬蹄蟹（美洲鱟）的阿米巴樣細(xì)胞溶解物制備的試劑可用于檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素。如圖3所示，在內(nèi)毒素的參與下，級(jí)聯(lián)反應(yīng)開(kāi)始進(jìn)行，其中C因子，一種絲氨酸蛋白酶前體，先被活化。隨后接下來(lái)的是B因子的活化，B因子也是一種絲氨酸蛋白酶前體和凝固酶前體，它能將凝集原水解成凝集素，形成不溶性凝膠。

在LAL測(cè)試中，內(nèi)毒素可以通過(guò)三種方式定量：

對(duì)凝膠的形成進(jìn)行測(cè)定
對(duì)濁度的增加進(jìn)行測(cè)定
或?qū)τ珊铣傻孜锓纸舛尫懦龅狞S色色原體進(jìn)行測(cè)定。

普通的LAL試劑不僅與內(nèi)毒素反應(yīng)，而且會(huì)與（1→3）-β-D-葡聚糖（真菌細(xì)胞壁成分）反應(yīng)，因?yàn)镚因子途徑會(huì)在LAL試劑作用下被激活。為了消除這種（1→3）-β-D-葡聚糖活化，在工業(yè)中通過(guò)去除G因子或抑制其活化，開(kāi)發(fā)了各種內(nèi)毒素特異性試劑。

市場(chǎng)上有著各種基于圖3中的反應(yīng)機(jī)理所制得的LAL試劑以及檢測(cè)體系。因此，根據(jù)所需的準(zhǔn)確度、測(cè)試頻率、樣本數(shù)目以及其他相關(guān)因素來(lái)選擇合適的產(chǎn)品是十分重要的。

圖3. LAL試劑反應(yīng)機(jī)理

美國(guó)，歐洲和日本的藥典中包含了三種內(nèi)毒素檢測(cè)方法，分別是凝膠法、比色法和比濁法，我們會(huì)在下面的章節(jié)中詳述，并且會(huì)介紹相關(guān)的LAL試劑的特點(diǎn)以及其應(yīng)用實(shí)例。

(1) 凝膠法

將樣本與LAL試劑在試管中混合，并使用干浴器，在37±1°C下，孵育60±2 min，期間不要振動(dòng)。加熱完成后，立即緩慢地將試管傾斜180°。如果凝膠已形成并能保持其完整性而不變形或塌陷，則結(jié)果可確定為陽(yáng)性，而如果未形成凝膠則為陰性。在檢測(cè)期間，對(duì)于一系列樣本，要進(jìn)行多倍稀釋（通常為2倍），以檢查每個(gè)樣品的結(jié)果是否為陽(yáng)性。

相關(guān)試劑：

在單次型試劑盒和多次型試劑盒中都包含LAL試劑，其中單次型試劑盒中的反應(yīng)小瓶包含了預(yù)分裝好的用于單次檢測(cè)的LAL試劑，而多次型試劑盒則是將所需量的已經(jīng)溶解好的LAL試劑裝入到反應(yīng)瓶中。單次型試劑盒適用于少量樣品的檢測(cè)，而多次型試劑盒則適用于樣本量更多的檢測(cè)。

多次型試劑盒的使用方法式是將0.1 mL已經(jīng)溶解好的LAL試劑分裝到反應(yīng)管中，然后再加入0.1 mL樣品，并將其混合。而單次型試劑盒的使用方法則是將0.2 mL樣本加入到含有預(yù)先分裝好的LAL凍干試劑的反應(yīng)小瓶中。

ES-II系列

特異性內(nèi)毒素LAL試劑（不會(huì)被（1→3）-β-D-葡聚糖活化），與細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)（BET）（日本藥典）相兼容。其膠凝靈敏度為0.015 EU/mL，單次型和多次型試劑盒均有提供。

（2）比色法

由于內(nèi)毒素會(huì)使LAL試劑活化，比色法是根據(jù)其對(duì)顯色底物的分解來(lái)檢測(cè)其活化。由于對(duì)硝基苯胺的黃色的吸光度是在405 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)的，如果樣品在約405 nm波長(zhǎng)下具有相當(dāng)大的光吸收，則不宜使用比色法。

相關(guān)試劑

Color KY 系列

內(nèi)毒素特異性比色法LAL試劑，與BET（日本藥典）一致性測(cè)試相兼容。與Toxinometer® 結(jié)合使用的單次型試劑盒，以及與酶標(biāo)儀和Toxinometer® 結(jié)合使用的多次型試劑盒，可用于動(dòng)態(tài)比色測(cè)試。這些系列在我們的試劑產(chǎn)品有著高的靈敏度：檢測(cè)限為0.0002 EU/mL（單次型）和0.0005 EU/mL（多次型）。

（3）比濁法

比濁法利用凝膠濁度的變化來(lái)檢測(cè)由內(nèi)毒素誘導(dǎo)所產(chǎn)生的LAL試劑的活化。它不適用于具有一定濁度的樣品。

ES-F系列和ES-II系列

在動(dòng)態(tài)比濁法測(cè)量中，可以將ES-F系列、ES-II系列與酶標(biāo)儀和Toxinometer® 結(jié)合使用。這些試劑盒不僅能獲得凝膠法的結(jié)果，同時(shí)能得到動(dòng)態(tài)比濁法的數(shù)據(jù)，測(cè)量時(shí)間為60 min。

【對(duì)檢測(cè)用具的要求】

用于內(nèi)毒素檢測(cè)的所有檢測(cè)用具必須不含內(nèi)毒素和β-葡聚糖。為使內(nèi)毒素失活，需要在250°C下干熱處理超過(guò)30 min。建議使用經(jīng)干熱滅菌的玻璃器皿。避免使用金屬工具，因?yàn)榧词褂猩倭勘幌疵摮龅慕饘匐x子（例如鐵，鋁，鎵，鉻），也可能影響測(cè)試。而當(dāng)使用一次性塑料工具（其制造商未能保證其能用于檢測(cè)用途）時(shí)，檢查它們是否滿足以下要求（與玻璃器皿相比）：1）未被內(nèi)毒素污染; 2）不吸附內(nèi)毒素; 3）無(wú)洗脫物。

【內(nèi)毒素產(chǎn)品列表】

貨號(hào)	品名	規(guī)格
295-72301	Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR (TM) ES-F SINGLE TEST SENSITIVITY 0.015 EU/mL (25 LAL Reagent vials + 1 CSE vial) 鱟阿米巴樣細(xì)胞裂解物PYROSTAR™ES-F單次測(cè)試靈敏度0.015 EU/mL	25 tests
291-75701	Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR ES-F MULTI TEST (without CSE) 鱟阿米巴樣細(xì)胞裂解物PYROSTAR™ES-F多次測(cè)試（不含CSE）	100 tests
295-51301	Limulus ES-2 Single Test wako 鱟試劑ES-2 Single（適用于溶膠凝膠法和動(dòng)態(tài)比濁法）	25 tests
299-51201	Limulus ES-2 Test wako 鱟試劑ES-2 （適用于溶膠凝膠法和動(dòng)態(tài)比濁法）	60 tests
292-51213	Limulus Amebocyte Lysate ES-II, Lyophilized 鱟試劑LAL ES-II（適用于溶膠凝膠法和動(dòng)態(tài)比濁法）	2 ml×5
293-75401	Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR ES-F/Plate (with CSE) 鱟阿米巴樣細(xì)胞裂解物PYROSTAR™ES-F/板（含CSE）	160 tests
297-75301	Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR ES-F/Plate (without CSE) 鱟阿米巴樣細(xì)胞裂解物PYROSTAR™ES-F/板（不含CSE）	200 tests
291-53601	Limulus Color KY Single Test wako 鱟試劑比色法KY單次測(cè)試	25 tests
291-53101	Limulus Color KY Test Wako 鱟試劑比色法KY多次型	60 tests
290-33771	Toxinometer ET-6000/J Standard Set 內(nèi)毒素檢測(cè)儀ET-6000/J	1 set
291-35761	Toxinometer ET-7000/J Standard Set 內(nèi)毒素檢測(cè)儀ET-7000/J（升級(jí)版）	1 set