PNAS：首次利用CRISPR-Cas9對古生菌進行基因組編輯

來源：作者：人氣：-發表時間：2017-03-13 09:39:00【大中小】

在一項新的研究中，來自美國伊利諾伊大學厄巴納-香檳分校的微生物學教授Bill Metcalf和博士后研究員Dipti Nayak首次記錄了在古生菌（Archaea，也譯作古細菌，或古菌）中使用CRISPR-Cas9介導的基因組編輯。他們的突破性工作有潛力在未來極大地加快研究這類有機體，包括對全球氣候變化的影響。相關研究結果于2017年3月1日在線發表在PNAS期刊上。

利用CRISPR-Cas9對古生菌進行基因組編輯

Nayak解釋道，“在大多數情形下，作為我們的模式古生菌，乙酸甲烷八疊球菌（Methanosarcina acetivorans）的倍增時間是8到10小時，而大腸桿菌能夠在大約30分鐘內增殖一倍。這意味著進行遺傳學研究和獲得突變體能夠需要數月時間，而同樣的事情在大腸桿菌中開展僅需三天。在通常情況下，CRISPR-Cas9能夠讓我們做的事情就是加快這整個過程。它解決了一個重大的瓶頸：在這種古生菌中開展遺傳學研究。”

Nayak繼續說道，“再者，利用我們之前的技術，必須一步一步地引入突變。利用這種新的技術，我們能夠同時引入多種突變。我們能夠利用CRISPR指數級地擴大這個突變體產生過程。”

CRISPR起初是作為細菌和古生菌中的一種免疫防御系統發揮作用。通過鑒定出和儲存短的外源病毒DNA片段，Cas蛋白能夠在未來快速地識別這種DNA片段，也因此能夠快速地破壞這種DNA片段，從而保護細菌和古生菌免受病毒再次入侵。

自從發現CRISPR-Cas9以來，它就經過改進在實驗室中對基因組進行編輯。通過將Cas9與一種經過特定改造的向導RNA（gRNA）配合使用，這種CRISPR系統能夠在任意位點上切割細胞的基因組以至于能夠移除現存的基因或者加入新的基因。這種系統已被廣泛地用于編輯真核系統，如酵母，植物，魚，甚至人細胞。然而，在原核生物中使用這種系統遇到了障礙，這部分上是由于它們的不同的細胞過程。

為了在細胞中使用CRISPR系統，研究人員必須開發出一種將細胞偏好的DNA修復系統考慮在內的操作方法：在CRISPR“分子剪刀”切割染色體后，細胞的修復系統介入進來，通過一種能夠被用來移除或添加附加的遺傳物質的機制修復這種DNA損傷。在真核細胞中，這種修復機制為非同源末端連接（Non-Homologous End Joining, NHEJ）。盡管這種機制用于CRISPR介導的基因組編輯中，但是它往往在修復過程中產生遺傳錯誤：作為DNA梯子中的橫檔，核苷酸經常在切割位點上被加入或移除。

NHEJ機制在包括古生菌在內的原核生物中是非常罕見的；相反，它們的DNA損傷更多的時候是通過一種被稱作同源重組修復（homology-directed repair, HDR）的機制加以修復的。通過將DNA損傷與一種DNA模板進行比較，HDR機制獲得一種“確定性的模板”，其最終結果能夠被提前預測，并且能夠按照研究人員的需要加以精確地調整。

Nayak解釋道，在很多方面，HDR機制確實適合于基因組編輯：“由于NHEJ的存在，我們想要在真核生物中利用CRISPR-Cas9進行定向編輯。就這點而言，大多數古生菌菌株并沒有NHEJ機制倒是個好消息，因此，它們的唯一能夠修復DNA的途徑就是這種確定性的同源修復機制（即HDR）。”

盡管看起來似乎違反直覺，Nayak和Metcalf的首批CRISPR-Cas9應用之一就是在乙酸甲烷八疊球菌中引入NHEJ機制。Nayak說，盡管通常不大適合用于基因組編輯，但是NHEJ也有優于HDR機制的地方：“如果你僅想要移除一個基因，如果不在乎如何移除...，那么NHEJ機制實際上更加高效。”

Nayak說，通過這種引入的NHEJ修復系統開展基因敲除研究，即單個基因被移除或沉默以便觀察會產生什么變化和這個基因可能影響哪些過程，未來的研究將能夠組裝出乙酸甲烷八疊球菌和其他的古生菌物種的基因圖譜。

Nayak說，“乙酸甲烷八疊球菌是遺傳上最容易處理的古生菌菌株之一。產甲烷菌是一類每年產生幾十億噸這種強效溫室氣體的古生菌，在全球碳循環中發揮著關鍵的作用，因此顯著地促進全球氣候變化。”通過研究乙酸甲烷八疊球菌（也是一種產甲烷菌）和其他的有機體，Nayak和Metcalf希望能夠更加深入地理解古生菌遺傳學特征以及它們在更加廣泛的環境過程中發揮的作用。

總之，這項研究代表著研究和操縱古生菌的一個激動人心的新方向。Nayak作出結論，“我們開展這項研究的目的在于確定在古生菌中進行CRISPR-Cas9基因組編輯是否是可行的。我們發現這不僅是可行的，而且它表現得非常好，甚至可與真核生物中的表現相比擬。”

原文來源

Cas9-mediated genome editing in the methanogenic archaeon Methanosarcina acetivorans