我國科學家開發出比CRISPR/Cas9更優的基因編輯系統
在一項新的研究中，來自中國河北科技大學和浙江大學醫學院的研究人員發現類似于CRISPR/Cas9，來自Argonaute蛋白家族的核酸內切酶也利用寡核苷酸作為向導降解入侵的基因組。具體而言，他們發現來自格氏嗜鹽堿桿菌（Natronobacterium gregoryi）的一種Argonaute蛋白（NgAgo）作為一種核酸內切酶，在向導DNA（guide DNA, gDNA）的引導下，能夠在人細胞中進行基因組編輯。相關研究結果于2016年5月2日在線發表在Nature Biotechnology期刊上，論文標題為“DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute”。論文通信作者為河北科技大學生物科學與工程學院韓春雨（Chunyu Han）副教授。
韓春雨(中)及其合作者沈嘯(左)、高峰(右)
基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜志列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短回文重復序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的，是細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防御系統。
在CRISPR/Cas9系統中，酶Cas9在DNA靶位點上進行切割，其中這種靶位點是這樣確定的：一種被稱作CRISPR RNA（crRNA）的RNA分子利用它的一部分序列與另一種被稱作tracrRNA的RNA分子通過堿基配對結合在一起，形成嵌合RNA（tracrRNA/crRNA），然后，借助crRNA的另一部分序列與靶DNA位點進行堿基配對，以這種方式，這種嵌合RNA就能夠引導Cas9結合到這個靶位點上并進行切割。在實際應用時，人們可以將tracrRNA和crRNA作為兩種向導RNA（gRNA）或者融合在一起形成單向導RNA（single guide RNA, sgRNA），并被用來引導酶Cas9結合到靶DNA序列上并進行切割，其中Cas9與sgRNA一起被稱作Cas9-sgRNA系統。
進一步的研究還證實，CRISPR/Cas9的基因組編輯能力只有在被稱作前間隔序列鄰近基序(protospacer adjacent motif, PAM)的短片段DNA序列的存在下才成為可能。只有DNA靶位點附近存在PAM時，Cas9才能進行準確切割。再者，PAM的存在也是激活酶Cas9所必需的。
盡管科學家們已采用多種方式對CRISPR/Cas9系統進行優化來提高它的效率和特異性，它仍然存在一些不足之處，如CRISPR/Cas9系統仍然會在脫靶位點（在這些位點上，gRNA與靶DNA序列之間存在錯配）進行切割，這種脫靶切割有可能導致很多有害的后果，如癌癥產生；向導RNA容易形成二級結構，等等。
來自格氏嗜鹽堿桿菌的Argonaute蛋白利用單鏈gDNA切割靶DNA
盡管來自嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus）的Argonaute蛋白（TtAgo）或來自強烈熾熱球菌（Pyrococcus furiosus）的Argonaute蛋白（PfAgo）在5’端發生磷酸化的單鏈DNA存在下能夠在體外切割DNA靶序列，但是它們都需要非常高的反應溫度（>65 °C），這就使得它們不能夠應用于哺乳動物細胞中。為了解決這一問題，研究人員利用PSI-BLAST搜索工具以TtAgo和PfAgo氨基酸序列為對象，在美國國家生物技術信息中心（NCBI）非冗余蛋白序列數據庫種進行搜索，從中鑒定出一種潛在的候選蛋白：來自格氏嗜鹽堿桿菌SP2菌株的Argonaute蛋白（即NgAgo）
![NgAgo uses 5[prime] phosphorylated ssDNA guides and cleaves DNA targets in vitro.](/UploadFiles/FCK/2016-05/201605106J2HLP868N.jpg "NgAgo uses 5[prime] phosphorylated ssDNA guides and cleaves DNA targets in vitro.")
NgAgo利用磷酸化單鏈DNA在體外引導和切割DNA目標
研究人員接著設計三種5’端發生磷酸化的長24個核苷酸的單鏈gDNA，其中兩種單鏈gDNA彼此互補（記為FW和RV），而且能夠結合到pACYCDuet-eGFP質粒的靶位點上；第三種單鏈gDNA含有隨機的堿基序列，但不與這種質粒互補（記為NC）。此外，他們還設計了一對5’端發生磷酸化的單鏈gRNA，它們也能夠結合這種相同的靶位點上。結果證實，在沒有gDNA存在時，或者在NC gDNA存在時，NgAgo都不能切割這種質粒。當FW或RV gDNA存在時，NgAgo能夠在37 °C下讓這種超螺旋的質粒產生切口。當FW和RV gDNA同時存在時，NgAgo能夠讓這種質粒線性化。但是，在5’端未發生磷酸化的單鏈gDNA或者5’端發生磷酸化的單鏈gRNA存在下，NgAgo都不能切割這種質粒。
因此，NgAgo當與5’端發生磷酸化的單鏈gDNA結合時能夠在37 °C下切割靶雙鏈DNA。
NgAgo結合單鏈gDNA，并導致靶DNA發生雙鏈斷裂
為了評估NgAgo是否能夠作為一種基因組編輯工具進行使用，研究人員首先在293T細胞中表達NgAgo，并研究它是否與人細胞中的內源性核酸結合，結果他們并未檢測到與從293T細胞中純化出來的NgAgo相結合的核酸，這提示著人細胞中存在的5’端發生磷酸化的單鏈DNA是非常少的，而且即便存在內源性的單鏈DNA，也不會將NgAgo引導到脫靶位點上。
研究人員利用編碼NgAgo的質粒和這些人工合成的長24個核苷酸的單鏈gDNA或gRNA（5’端發生或未發生磷酸化）轉染293T細胞時，發現NgAgo只能結合5’端發生磷酸化的單鏈gDNA，而不能結合單鏈gRNA和5’端未發生磷酸化的單鏈gDNA。
當將編碼NgAgo的質粒轉染到293T細胞24小時后再將5’端磷酸化的單鏈gDNA運送到這些細胞中時，研究人員發現NgAgo結合單鏈gDNA的數量顯著下降，這提示著當NgAgo表達時，它只有在較短的時間內裝載單鏈（或者說結合）gDNA。與這相一致的是，當從293T細胞中純化出來的未裝載單鏈gDNA的NgAgo在37 °C下即便與單鏈gDNA在體外孵育長達8小時，單鏈gDNA也不會裝載到NgAgo上。再者，單鏈gDNA在體外只能在比較高的溫度（55 °C）下裝載到NgAgo上。只有從已進行單鏈gDNA轉染的293T細胞中純化出來的NgAgo，而不是在37 °C下與單鏈gDNA（FW gDNA，或者RV gDNA）孵育的NgAgo，才能在體外切割靶DNA。
進一步的實驗證實從已進行NC gDNA轉染的293T細胞中純化出來的NgAgo隨后在37 °C下即便與FW gDNA在體外孵育8小時也不能切割靶DNA。這些結果表明NgAgo非常忠實于它的初始單鏈gDNA，不能夠在37 °C下進行單鏈gDNA交換。不過在55 °C下，NgAgo能夠交換單鏈gDNA，即重新裝載單鏈gDNA，但這時，NgAgo不能象37 °C下裝載單鏈gDNA時那樣高效地切割靶DNA，這是因為55 °C高溫會降低NgAgo的酶活性。此外，在切割靶DNA時，NgAgo會在雙鏈DNA（不是單鏈DNA）的靶位點內移除幾個核苷酸。
研究人員在哺乳動物細胞中比較NgAgo-gDNA系統和Cas9-sgRNA系統的編輯效率，發現NgAgo-gDNA系統讓靶基因失活的效率與Cas9-sgRNA系統一樣高。利用這種方法，他們還證實對NgAgo而言，單鏈gDNA的最佳長度是24個核苷酸左右。
廣泛的基因組靶向范圍和較低的錯配耐受性
研究人員測試了NgAgo對人基因組上的內源性靶位點進行編輯的能力。為此，他們對NgAgo進行修飾，將一種核定位信號（nuclear localization signal）附著到它的氨基端上確保NgAgo位于細胞核中。他們設計出5個針對人DYRK1A基因第11外顯子的單鏈gDNA，然后通過T7核酸內切酶I（T7EI）檢測和DNA測序，證實這5個gDNA均能引導NgAgo高效地切割靶DNA序列。
研究人員還測試47個靶向作用于8種不同基因的單鏈gDNA，他們發現這些gDNA的基因組編輯效率（21.3～41.3%）具有可比性，而且也沒有觀察到NgAgo對具有特定性質的序列具有明顯的偏好性。
研究人員還在包括乳腺癌細胞系MCF-7、人骨髓細胞系K562和HeLa細胞系在內的多種哺乳動物細胞系中測試了NgAgo-gDNA系統，結果發現在所有這些細胞系中，NgAgo都能夠高效地誘導DYRK1A基因靶位點發生雙鏈斷裂。
為了研究單鏈gDNA與靶DNA序列之間的核苷酸錯配對NgAgo活性的影響，研究人員先針對一個DYRK1A基因靶位點設計出一個長24個核苷酸的單鏈gDNA，然后在這個單鏈gDNA的每個位置上引入單核苷酸錯配。他們發現NgAgo介導的靶DNA切割對這個gDNA每個位置上的單核苷酸錯配非常敏感：切割效率下降了73～100%，其中P8～P11位置上發生的單核苷酸錯配導致最大的切割效率下降（85~100%）。他們還發現任何3個連續位置發生錯配會完全破壞這種切割。
為了研究當單鏈gDNA長度發生變化時，NgAgo是否仍然對單核苷酸錯配敏感，研究人員合成出長21個核苷酸的單鏈gDNA，結果發現這個長度縮短的gDNA任何位置上發生的單核苷酸錯配仍然極大地破壞NgAgo活性；盡管gDNA長度發生變化，P8～P11位置上發生的單核苷酸錯配仍然是破壞NgAgo活性最大的關鍵位置。考慮到Cas9-sgRNA系統甚至能夠耐受5個核苷酸錯配，這些實驗初步地證實NgAgo-gDNA系統是高度保真的。
研究人員比較了NgAgo-gDNA和Cas9-sgRNA系統切割哺乳動物基因組上的DYRK1A基因靶位點的效率，結果發現兩者的切割效率是可比的（前者是31.97%，后者是32.2%）。接著，他們還研究了NgAgo-gDNA在靶向切割富含G+C的DNA位點上是否優于Cas9-sgRNA。確實，他們證實相比于NgAgo-gDNA，Cas9-sgRNA切割HBA2基因和GATA4基因上富含G+CDNA位點的效率要差很多。因此，NgAgo-gDNA系統比Cas9- sgRNA有潛力用于更為寬廣的基因組位點。再者，Cas9要發揮切割作用，必須要求靶位點緊靠在PAM的上游，而諸如NgAgo之類的Argonaute蛋白則沒有這種靶序列限制。
NgAgo準確地將DNA片段插入到基因組中
為了驗證NgAgo能夠靶向切割哺乳動物基因組，研究人員測試了NgAgo-gDNA系統是否能夠被用來編輯基因組。同源重組修復（homology-directed Repair, HDR）介導的供者序列捕獲是一種廣泛采用的策略，可被用來產生特異性的基因組修飾。為此，研究人員設計出一種由報告基因區和G418抗性基因組成的供者DNA片段，其中這種報告基因區由兩個閱讀框組成：一個閱讀框編碼mRFP，另一個是無法閱讀的編碼eGFP的序列，這兩個閱讀框由TGA終止子分隔開。這種報告基因區沒有啟動子，因此正常情形下，不會表達。在將編碼NgAgo的質粒、單鏈gDNA和這種供者DNA片段轉染進293T細胞后，研究人員檢測到表達mRFP的細胞，并且證實在這些細胞中，供者DNA片段準確地插入到所需的位點中。在進行G418篩選后，他們分離出含有這種供者DNA片段的細胞克隆株。
此外，研究人員還利用NgAgo-gDNA系統靶向切割這種陽性細胞克隆株中的TGA終止子。由非同源性末端連接（nonhomologous end joining, NHEJ）介導的不精準基因組修復讓這種TGA終止子發生突變，從而使得mRFP-eGFP嵌合蛋白表達。利用流式細胞儀進行分析，他們檢測到11.7%的細胞是eGFP陽性的，這就證實NgAgo-gDNA能夠對哺乳動物基因組進行高效地編輯。
最后，當利用Cas9-sgRNA和NgAgo-gDNA系統---其中，Cas9的劑量和NgAgo的劑量相同---分別導入293T細胞中靶向基因組相同位點時，Cas9而不是NgAgo導致供者DNA片段插入到脫靶位點中。
總之，這種NgAgo-gDNA系統設計方便，gDNA可直接轉染細胞，而無需構建專門的gDNA表達載體；NgAgo可編輯基因組內任何位點，而Cas9的基因組靶點必須位于PAM序列的上游，而且不能富含G+C；所使用的gDNA是DNA而非RNA，不會像RNA那樣容易形成二級結構而導致失效或脫靶效應；對游離于細胞核的DNA具有更高的切割效率。由此可知，相比較于Cas9-sgRNA，NgAgo-gDNA具有更大的優勢，規避了令人頭痛的脫靶效應，其應用前景是不言而喻的。更難能可貴的是，在Cas9-sgRNA成為全世界各大實驗室爭相使用的香餑餑時，這項研究發現的新基因編輯系統具有如此巨大的優勢，向它發出有力的挑戰，也難怪也會在國內引發一陣熱潮。
文章內容轉載自：DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute
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