大部分蛋白在經(jīng)過糖基化等翻譯修飾后都可作為功能蛋白發(fā)揮作用。糖鏈被稱為繼基因、蛋白質(zhì)之后的第三生命鏈，并與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞應(yīng)答等多種生命現(xiàn)象相關(guān)。另外，癌癥、免疫疾病、感染病、阿爾茨海默癥等大多是與糖鏈相關(guān)的疾病，尤其是癌癥，癌癥的轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖等已闡明了糖鏈的重要性。在癌癥的診療法的開發(fā)中，對于糖鏈研究的期待值很高，闡明糖鏈的分子生物學(xué)意義已成為重要的課題之一。

與鏈狀的核酸和氨基酸序列相比，糖鏈存在多樣性的分支和不同的結(jié)合形式（α，β- 結(jié)合），糖鏈不能像核酸那樣擴(kuò)增，并且只限使用蛋白質(zhì)樣探針（抗體）進(jìn)行解析，這使得糖鏈的分析更為困難。然而，近期以質(zhì)譜，微陣列技術(shù)為中心的糖鏈分析技術(shù)發(fā)生了驚人的革新，迄今為止已經(jīng)報道了許多新的糖鏈腫瘤標(biāo)記以及開發(fā)方法的案例。糖鏈這種高門檻的研究，隨著這些技術(shù)的革新，現(xiàn)在使得每個人都可以輕松地進(jìn)行分析研究。至今為止，研究人員利用結(jié)構(gòu)特異性識別糖鏈的結(jié)合蛋白，并固定了幾十種凝集素的凝集素微陣列系統(tǒng)，進(jìn)而促進(jìn)了各類糖鏈生物標(biāo)記物的開發(fā)。

本方法較大的優(yōu)點是與質(zhì)譜分析相比，其靈敏度與通量方面更為優(yōu)越（圖1）。作為本系統(tǒng)應(yīng)用的一環(huán)，能夠?qū)嵤Χ喾N生物樣本進(jìn)行解析的實驗方案，現(xiàn)在，凝集素陣列（Lectin‐Array）分析的對象涉及多方面，如體液、組織、細(xì)胞等等。粒子狀的外泌體與細(xì)胞相比粒徑雖然很小，但其表面卻存在無數(shù)的糖蛋白、糖脂糖鏈。因此，可以成為很好的凝集素陣列分析對象。凝集素陣列（Lectin‐Array）分析是通過幾十種的凝集素結(jié)合方式來推斷糖鏈結(jié)構(gòu)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)與比較對象有差異的糖鏈（凝集素）模式，這被稱為糖鏈分析。我們采用的外泌體分析實驗是將提純的外泌體粒子上的蛋白標(biāo)記熒光。因此，外泌體的回收及其顆粒形態(tài)的保持是十分重要的。另外，因為凝集素微陣列具有高靈敏度，即使回收量低也可以進(jìn)行分析，但是如果混入其他糖蛋白的話就會造成干擾，不能進(jìn)行正確的糖鏈分析。因此，對提取的外泌體的純度是有要求的。

為了能夠得到高純度并保持完整顆粒狀態(tài)的外泌體，使用MagCapture^TM Exosome Isolation Kit PS （下文簡稱為MagCapture）進(jìn)行了外泌體提取實驗。該試劑盒在后述的血液中外泌體糖鏈分析時發(fā)揮了出色的作用。

圖1.　凝集素微陣列系統(tǒng)和外泌體糖鏈分析的流程

首先，我們以培養(yǎng)細(xì)胞作為模型，從培養(yǎng)上清中分離、提取外泌體，接著嘗試通過凝集素微陣列進(jìn)行糖鏈分析比較。作為比較對象，從相同細(xì)胞株的沉淀中提取細(xì)胞膜蛋白，并對蛋白上的糖鏈進(jìn)行分析比較（圖2）。從3種類型的胰腺癌細(xì)胞株（Capan-1,-2, HPAF-II）中獲得的凝集素陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行層次聚類分析后發(fā)現(xiàn)，這些數(shù)據(jù)不是反映細(xì)胞株之間的差別，而是出色地反映出了膜蛋白和外泌體之間凝集素的差異（圖2A）。說明了即使是相同的細(xì)胞株，其細(xì)胞膜糖蛋白上糖鏈和分泌的外泌體上糖鏈的結(jié)構(gòu)也是不同的。另外，即使都是外泌體，它詳細(xì)的糖鏈圖譜結(jié)果也是不同的（圖2B），由此可以看出，將外泌體用作糖蛋白分析比較的標(biāo)記是可行的。

圖2.　胰腺癌細(xì)胞來源外泌體和細(xì)胞膜糖蛋白的糖鏈比較圖

（A）通過層次聚類分析進(jìn)行clustering
（B）各細(xì)胞株來源細(xì)胞膜蛋白，外泌體表層糖鏈的凝集素陣列結(jié)合形式

以培養(yǎng)上清液作為模型的外泌體分析已取得了一定程度的進(jìn)展。進(jìn)行血清來源外泌體的比較分析時，由于含有混雜的糖蛋白，因此要極為小心。換言之，在進(jìn)行血液中外泌體糖鏈分析時，提取高純度的外泌體是十分重要的。

比較了超離法、聚合物沉淀法和MagCapture三種外泌體提取方法并進(jìn)行糖鏈的分析。使用超離法和聚合物沉淀法時，健康者和癌癥患者的糖鏈分析結(jié)果的差異不是很大。原因是用該類方法提取的外泌體組分用電泳分析后，可以看到過量的以球蛋白為首的血清糖蛋白的條帶，這會干擾糖鏈的分析比較。

而血清外泌體糖鏈分析中，使用可以提取高純度外泌體的MagCapture可能是合適的試劑盒。最后根據(jù)MagCapture試劑盒提取外泌體的實驗流程，作為凝集素陣列分析中必要使用的外泌體量，在換算后僅相當(dāng)于數(shù)微升的血清樣品量，因此，確認(rèn)該方法可以用于血液中高靈敏度的外泌體糖鏈分析比較實驗。并且本試劑盒提取的外泌體可以很好的保持完整顆粒狀態(tài)。根據(jù)該實驗流程，實際上可以在健康者和疾患群（A、B、C）混合血清中進(jìn)行外泌體的比較糖鏈分析。分析主要成分的結(jié)果中顯示，各患者血清外泌體表層的糖鏈分析結(jié)果都有所不同（圖3），建議將外泌體糖鏈作為新的外泌體診斷指標(biāo)。

圖3.　血清外泌體的比較糖鏈分析圖

（A）各混合血清中提取外泌體的銀染和抗CD63抗體蛋白印跡
（B）使用了凝集素陣列分析數(shù)據(jù)的主要成分分析

現(xiàn)在正在嘗試開發(fā)臨床應(yīng)用的糖鏈外泌體標(biāo)記物。以基因組和蛋白組學(xué)分析為中心的外泌體的本質(zhì)正逐漸被闡明。近年，隨著不斷創(chuàng)新的血液中外泌體檢測方法的開發(fā)，對外泌體進(jìn)行定量檢測成為了可能，使其臨床應(yīng)用也更進(jìn)了一步。如果可以發(fā)現(xiàn)疾病特異性外泌體糖鏈，就可以期待應(yīng)用這樣創(chuàng)新的外泌體定量系統(tǒng)，開發(fā)出實用的標(biāo)記物。通過與其他組學(xué)分析的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)特異性糖鏈的驗證方法等還有很大的改良空間，但是我們已經(jīng)邁出了外泌體糖鏈標(biāo)記物開發(fā)的第一步。

1）Kuno, A. et al. : Nat. Methods, 2, 851 （2005）.
2）Matsuda, A. et al. : Hepatology, 52, 174 （2010）.
3）Matsuda, A. et al. : Anal. Chem., 87, 7274 （2015）.
4）Yoshioka, Y. et al. : Nat. Commun., 5, 3591 （2014）.
5）Kabe, Y. et al. : Clin. Chem., 64, 1463 （2018）.

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