重大進展！開發出一種新的DNA合成方法

來源：作者：人氣：-發表時間：2018-07-02 16:06:00【大中小】

在一項新的研究中，來自美國加州大學伯克利分校、勞倫斯伯克利國家實驗室和聯合生物能源研究所的研究人員發明了一種合成DNA的新方法。這種方法有望更容易地更快速地合成DNA，并不需要使用毒性化學物，而且可能是更準確的。鑒于具有更高的準確性，這種技術能夠產生比當前的方法長10倍的DNA鏈。這些研究人員說，這種易用性可能會導致研究實驗室中普遍存在的“DNA打印機”，類似于如今許多車間中的三維打印機。相關研究結果于2018年6月18日在線發表在Nature Biotechnology期刊上，論文標題為“De novo DNA synthesis using polymerase-nucleotide conjugates”。加州大學伯克利分校研究生Dan Arlow和德國達姆施塔特工業大學博士生Sebastian Palluk在這項研究中詳細描述了這種方法。

圖片來自Marilyn Chung, Berkeley Lab。

Arlow說，“如果你是一名機械工程師，在你的商店里有一臺3D打印機真的很棒，它可以在一夜之間打印出零件，這樣你就可以在第二天早上測試它。如果你是一名研究人員或生物工程師，而且你有一種簡化DNA合成的儀器，即'DNA打印機'，那么你就能夠更快地測試你的想法并嘗試更多的新想法。我認為這將帶來很多創新。”

聯合生物能源研究所首席執行官、勞倫斯伯克利國家實驗室資深科學家和加州大學伯克利分校化學與生物分子工程教授Jay Keasling說，“我個人認為Arlow和Palluk開發出的這種新方法可能會引發我們制造DNA方法的變革。”

Palluk在Keithling實驗室與Arlow一起研究DNA合成問題。作為合成生物學領域的先驅，Keasling和聯合生物能源研究所的科學家們致力于將基因導入到微生物（主要是酵母和細菌）中來可持續地產生產品---藥物、燃料，工業化學品，同時產生最少的毒性副產物和消耗最少的能源。

40年的合成過程

合成DNA是一項不斷發展的業務，這是因為公司訂購定制的基因，這樣它們就能夠在培養微生物的大缸中產生生物藥物、工業酶或有用的化學物質。科學家們購買合成基因，并將它們導入到植物或動物體內或者嘗試著開展新的基于CRISPR的疾病治療方法。

一些科學家甚至提出將信息存儲在DNA中，就像如今將數字數據存儲在計算機硬盤中一樣，這是因為一克DNA在理論上的存儲容量相當于5000萬張DVD，并且應當會在數百年內保持穩定。然而，這意味著要合成的DNA鏈數量比目前在生物技術行業中使用的DNA鏈數量大得多。所有這些應用都要求這種DNA合成過程在數百萬甚至數十億個DNA分子拷貝中忠實地產生所需的核苷酸或堿基---DNA的構成單元（building block）---序列。

目前的DNA合成方法可追溯到1981年并使用來自有機化學實驗室的技術，僅限于直接產生大約長200個堿基的寡核苷酸，這是因為隨著合成長度的增加，這個過程中出現的不可避免的錯誤導致正確序列的產率非常低。為了組裝一個小的基因，科學家們必須逐段合成它，每段大約長200個堿基，然后將這些片段拼接在一起。這很費時，通常需要多次嘗試，而且有時完全失敗。

此外，如果從Twist Biosciences公司和Integrated DNA Technologies（IDT）公司等合成公司訂購，那么合成一個大約長1500個堿基的小基因的周轉時間可能為兩周，需要花費300美元，這就限制了科學家們能夠承擔得起的嘗試進行基因調整的數量和他們開始能夠開展實驗的速度。 Keasling、Arlow和Palluk等合成生物學家經常需要一次性地將十幾種不同的基因插入一種微生物中，使其產生所需的化學物質，然而每個基因都存在它自己的合成問題。

Palluk說，“作為一名德國學生，我參加了國際合成生物學競賽iGEM，在那里我們試圖讓大腸桿菌降解塑料廢物。但是我很快就意識到大部分研究時間都用于合成DNA，而不是開展實驗來觀察所獲得的工程細胞是否能夠降解塑料。這真地促使我研究DNA合成過程。”

化學DNA合成還需要使用特定類型的有毒性的活化DNA構成單元，并重復使用石油衍生溶劑進行清洗。Arlow說，如今，廢物處理的問題和這種合成過程對濕度非常敏感使得它非常挑剔的事實都成為科學家們拋棄他們的個人寡核苷酸合成儀并將他們的DNA交給專業公司進行合成的理由。

借鑒免疫系統

這項新的技術依賴于在免疫系統細胞中發現的一種DNA合成酶，這種DNA合成酶天然地能夠將核苷酸添加到水中的現有DNA分子上。這種技術有望提高精確度，并可能讓DNA鏈的合成時間延長10倍，從而能夠合成出長數千個堿基的DNA分子---一個中等基因的大小。

Palluk說，“我們已想出一種合成DNA的新方法，它利用了大自然用來制造DNA的機器。這種方法很有前途，因為酶已進化了數百萬年才能完成這種精確的化學反應。”

細胞通常不會從頭開始合成DNA；它們主要都是在已存在于它們中的DNA模板的基礎上，利用大量不同的聚合酶進行DNA復制。然而，在20世紀60年代，科學家們發現了一種不尋常的聚合酶，它不依賴于現有的DNA模板，而是隨機地將核苷酸添加到制造用于免疫系統中的抗體的基因上。這種被稱作末端脫氧核苷酸轉移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT）的酶在這些基因中產生隨機變異，從而使得產生的抗體蛋白能更好地靶向前所未見的入侵者。

Paldk說，TdT同等地很好地添加所有四種DNA核苷酸，不會發生能夠破壞所形成的DNA分子的副產物，并且它的添加速度是非常快的，如果讓它隨心所欲地發揮作用的話，它每分鐘可將DNA延長大約200個堿基。

多年來，許多實驗室都已嘗試著利用這種酶來合成所需的DNA序列，但這種酶是很難控制的。一個關鍵要求就是弄清楚如何讓這種酶在添加一個核苷酸后停下來，這樣就能夠一次添加一個堿基從而合成出所需的序列。所有之前的方案都是試圖通過使用攜帶著阻止多次添加的特殊阻斷基團的修飾核苷酸來實現這種控制。在給DNA分子添加一個受到阻斷的核苷酸后，這些阻斷基團就被移除，從而使得接下來的添加成為可能。

Palluk說，“這些方法與下一代測序（Next-Generation Sequencing, NGS）技術有很多共同之處”，他指的是用于讀取基因序列的最先進技術，其工作原理是通過使用模板依賴性聚合酶依次地添加發出不同顏色熒光的阻斷核苷酸，從而指出添加了這四種可能的堿基中的哪一種。盡管這些用于測序的DNA復制酶能夠容納添加到DNA分子上的核苷酸攜帶的阻斷基團，但是TdT卻不能做到這一點。當一個核苷酸正確地定位用于DNA合成反應時，TdT的活性位點太緊而不適合容納它攜帶的阻斷基團。

Arlow的想法是將一個未攜帶阻斷基團的核苷酸牢固地連接到TdT上，這樣在將這個核苷酸添加到延伸中的DNA分子后，這種酶仍然保持連接并且保護DNA鏈的末端免受進一步的核苷酸添加。在DNA分子延伸后，他們切斷TdT與這個添加到DNA鏈上的核苷酸之間的連接物，將這種酶釋放出來，并讓DNA鏈的末端重新暴露出來以便接受進一步的核苷酸添加。

在他們的第一次試驗---使用經過改造的TdT酶在10個循環中產生長10個堿基的寡核苷酸---中，這些研究人員證實他們的更快更簡單的技術在每一步合成中幾乎與當前的技術一樣準確。

Arlow說,“當我們利用NGS技術分析合成產物時，我們能夠確定大約80％的分子具有所需的長10個堿基的序列。這意味著，平均每個步驟的產率大約為98％，這對解決這個存在了50多年的問題的第一次嘗試來說并不算太壞。我們希望達到99.9％的保真度，以便合成出全長DNA。”

Palluk說，一旦達到99.9％的保真度，他們就能夠一次性合成一種長1000個堿基的分子，產率在35％以上，對目前的化學合成技術來說，這是完全不可能實現的。

他說，“通過直接合成更長的DNA分子，將寡核苷酸拼接在一起的必要性以及由這個繁瑣的過程產生的限制可能就會減少。我們的夢想是直接合成基因長度的序列，并在幾天內將它們提供給科學家們。”

Arlow說“我們希望這種技術將使得生物工程師更容易更快地弄清楚如何通過生物手段制造出有用的產品，這可能導致以一種需要更少石油的方式更可持續地生產我們在世界上所依賴的東西，包括服裝、燃料和食品。”

參考資料：

Sebastian Palluk, Daniel H Arlow, Tristan de Rond et al. De novo DNA synthesis using polymerase-nucleotide conjugates. Nature Biotechnology, Published online: 18 June 2018, doi:10.1038/nbt.4173