4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（o-PNPBG）如何用于檢測β-葡萄糖苷酶？

來源：作者：人氣：-發(fā)表時間：2017-12-12 16:40:00【大中小】

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Q: 4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（o-PNPBG）如何用于檢測β-葡萄糖苷酶？

A: 4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷按以下規(guī)程用于β-葡萄糖苷酶檢測，不過緩沖溶液可以配合受檢的酶溶液的pH值進行調(diào)整。

所需材料:

緩沖溶液: - 0.1 M 醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.0)。

酶底物溶液: 4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（10mM）。
稱量301毫克的4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，加入150 ml耐熱燒杯中，加入95毫升0.1M的醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.0)。攪拌溶液直至底物全溶解（大約10分鐘）。用0.1M的醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.0)調(diào)節(jié)體積至100毫升。加入0.02 g疊氮鈉以防止微生物污染。將溶液儲存于一個密閉的Duran瓶中。日常使用時取10毫升加入聚丙烯試管中。注意不要頻繁從酶底物儲備液中取用。所有容器都應(yīng)置于4攝氏度下儲存。

酶制備液:
用GILSON的微量移液器精確將1.0毫升均勻的酶懸浮液轉(zhuǎn)移到一個100毫升的容量瓶中，然后用0.1M的醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.0)定容。接下來按照0.5毫升酶溶液和4.5毫升緩沖液的比例（10倍）稀釋酶制備液，混合均勻，重復上述步驟直至獲得適合分析的稀釋液。

上述操作推薦使用Gilson移液器，預設(shè)0.5ml，用于轉(zhuǎn)移酶制備液；Eppendorf多道移液器用于轉(zhuǎn)移4.5ml緩沖液（5道設(shè)置為2.5毫升，4道設(shè)置為2毫升）。

檢測過程:

40攝氏度下，預培養(yǎng)置于玻璃試管(16 x 100 mm)中的酶底物溶液（0.2毫升）5分鐘

40攝氏度下，預培養(yǎng)酶稀釋溶液（約5毫升）5分鐘。

嚴格按時間間隔（大約15秒），往含有0.2毫升底物溶液的試管底部加入0.2毫升酶溶液，劇烈震蕩混合試管內(nèi)容物，然后培養(yǎng)試管（一式四份）10分鐘左右。

培養(yǎng)結(jié)束前，加入3.0毫升2%的磷酸三鈉溶液(pH 12.0)終止反應(yīng)，并劇烈攪拌。

準備反應(yīng)空白溶液（一式兩份），將3.0毫升2%的磷酸三鈉溶液(pH 12.0)加入0.2毫升底物溶液中，劇烈攪拌。然后加0.2毫升酶溶液，劇烈攪拌。

按以下步驟測量吸光度值(400 nm):

- 用蒸餾水校正分光光度計的零點
- 檢測反應(yīng)空白樣相對于水的吸光度，并記錄(僅供參考).
- 用蒸反應(yīng)空白樣校正分光光度計的零點
- 檢測所有其它溶液相對于反應(yīng)空白樣的吸光度

活性計算公式如下:

1個單位酶活性，是每分鐘在較佳pH和40攝氏度下將1微摩爾PNP底物水解成pNP和底物所需要的酶的數(shù)量。