我國食品行業氨基酸的測定方法簡介

來源：作者：人氣：-發表時間：2015-10-22 14:56:00【大中小】

在分析化學、生物化學以及醫學等領域，作為一種基礎檢測手段，氨基酸的測定發揮了重要的作用。氨基酸分析方法經過多年發展，進步顯著并日趨完善。質譜（MS）、核磁（NMR）和液相色譜（HPLC）聯用技術被應用于氨基酸的測定中，使檢測結果的準確性不斷提高。氨基酸分析，按照分析過程中是否進行衍生，可以分為直接分析法和衍生化間接分析法。

由于氨基酸種類豐富，結構相似，僅很小部分能產生紫外或熒光相應，為了提高分析檢測靈敏度和分離選擇性，讓氨基酸衍生化，接上發光或發色基團，然后進行定性定量分析，該方法成為衍生化間接分析法。衍生化間接分析法按衍生時間不同分為柱前衍生法和柱后衍生法。柱后衍生化是首先將樣品組分利用色譜柱分離，然后進行衍生化處理并檢測的過程。衍生試劑一般為茚三酮和鄰苯二甲醛。柱后衍生技術與柱前衍生技術相比，其優點是反應重復性好；缺點是限制了衍生化條件。

目前我國在食品/飼料行業領域，以下相關國家標準正在實施，其中測定游離氨基酸涉及的主要檢測方法為：茚三酮柱后衍生化法和高效液相色譜法。

GB/T 18654.11-2008	養殖魚類種質檢驗第11部分：肌肉中主要氨基酸含量的測定
GB/T 18246-2000	飼料中氨基酸的測定
GB/T 5009.124-2003	食品中氨基酸的測定
GB/T 8314-2013	茶游離氨基酸總量的測定
GB/T 30987-2014	植物中游離氨基酸的測定
GB/T 14924.10-2008	實驗動物配合飼料氨基酸的測定
GB/T 32016-2015	蠶絲氨基酸的測定

現以GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》為例，簡述使用氨基酸自動分析儀測定食物中氨基酸的方法，其原理是：食品中的蛋白質經鹽酸水解成為游離氨基酸，經氨基酸分析儀的離子交換柱分離后，與茚三酮溶液產生顏色反應，再通過分光光度計比色測定氨基酸含量。

該方法適用于食品中的天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、擷氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸等十六種氨基酸的測定。其最低檢出限為10pmol。不適用于蛋白質含量低的水果、蔬菜、飲料和淀粉類食品中氨基酸測定。

試劑

濃鹽酸：優級純。

6mol/L鹽酸：濃鹽酸與水1+1混合。

苯酚：須重蒸餾。

混合氨基酸標準液（0.0025mol/L）（貨號：013-08391，H型，5ml/019-08393，1ml*5A）。

緩沖液（貨號：608-07461 日立氨基酸分析儀專用緩沖液套裝 L-8500-PH）

♦ pH2.2的檸檬酸鈉緩沖液(604-07463 L-8500-PH-1 1L×10)：稱取19.6g檸檬酸鈉（Na₃C₆H₅0₇·2H₂O）和16.5 ml濃鹽酸加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或500g/L的氫氧化鈉溶液調節pH至2.2

♦ pH3.3的檸檬酸鈉緩沖液(608-07466 L-8500-PH-2 1L×10)：稱取19.6g檸檬酸鈉和12ml濃鹽酸加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或500g/L的氫氧化鈉溶液調節pH至3.30

♦ pH4.0的檸檬酸鈉緩沖液(606-07462 L-8500-PH-3 1L×10)：稱取19.6g檸檬酸鈉和9ml，濃鹽酸加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或500g/L的氫氧化鈉溶液調節pH至4.00

♦ pH3.3的檸檬酸鈉緩沖液(602-07464 L-8500-PH-4 1L×10)：稱取19.6g檸檬酸鈉和46.8g氯化鈉（優級純）加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或500g/L的氫氧化鈉溶液調節pH至6.40

茚三酮溶液（299-70501, 日立氨基酸分析儀配套茚三酮顯色液, L-8500, L-8900均適用）

♦ pH5.2的乙酸鋰溶液：稱取氫氧化鋰(LiOH·H₂O)168g，加入冰乙酸（優級純）279ml，加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或500g/L的氫氧化鈉溶液調節pH至5.2,

♦ 茚三酮溶液：取150mL二甲基亞礬(C₂H₆OS)和乙酸鋰溶液50mL加人4g水合茚三酮（C₉H₄O₃·H₂O）和0.12g 還原茚三酮(C₁₈H₁₀O₆·2H₂O）攪拌至完全溶解。

高純氮氣：純度99.99%。

冷凍劑：市售食鹽與冰按1+3混合。

儀器和設備

♦ 真空泵。

♦ 恒溫干燥箱。

♦ 水解管：耐壓螺蓋玻璃管或硬質玻璃管，體積20mL-30mL。用去離子水沖洗干凈并烘干。

♦ 真空干燥器（溫度可調節）。

♦ 氨基酸自動分析儀

試樣處理

試樣采集后用勻漿機打成勻漿（或者將試樣盡量粉碎、于低溫冰箱中冷凍保存，分析用時將其解凍后使用。

分析步驟

♦ 稱樣

準確稱取一定量均勻性好的試樣如奶粉等，精確到0.0001g ,（使試樣蛋白質含量在10mg~20mg范圍內）；均勻性差的試樣如鮮肉等，為減少誤差可適當增大稱樣量，測定前再稀釋。將稱好的試樣放于水解管中

♦ 水解

在水解管內加6mol/L鹽酸10ml~15ml（視試樣蛋自質含量而定），含水量高的試樣（如牛奶）

可加入等體積的濃鹽酸，加人新蒸餾的苯酚3滴-4滴，再將水解管放人冷凍劑中，冷凍3min~5min，再接到真空泵的抽氣管上，抽真空（接近0Pa)，然后充人高純氮氣；再抽真空充氮氣，重復二次后，在充氮氣狀態下封口或擰緊螺絲蓋將已封口的水解管放在110℃+1℃的恒溫千燥箱內，水解22h后，取出冷卻。

打開水解管，將水解液過濾后，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液全部轉移到50ml容量瓶內用去離了水定容。吸取濾液1ml于5ml容量瓶內，用真空十燥器在40℃~50℃干燥，殘留物用1mL~2mL水溶解，再干燥，反復進行兩次，最后蒸干，用1mL pH2.2的緩沖液溶解，供儀器測定用。

測定

準確吸取0.200mL混合氨基酸標準，用pH2.2的緩沖液稀釋到5mL，此標準稀釋液濃度為5.00nmol/50μL，作為上機測定用的氨基酸標準，用氨基酸自動分析儀以外標法測定試樣測定液的氨基酸含星。

結果計算
按下式計算：

式中：

X ------------- 試樣氨基酸的含量，單位為克每百克（g/100g）；
c ------------- 試樣測定液中氨基酸含量，單位為納摩爾每50微升(nmol/50μL)；
F ------------- 試樣稀釋倍數；
V ------------- 水解后試樣定容體積，單位為毫升（mI）；
M ------------ 氨基酸分子量；
m ------------ 試樣質量，單位為克（g）；
1/50 --------- 折算成杯毫升試樣測定的氨基酸含量，單位為微摩爾每升（μmol/L）;
10⁹ ---------- 將試樣含量由納克（ng）折算成克（g）的系數。

十六種氨基酸分子量：

天冬氨酸:133.1；蘇氨酸:119.1；絲氨酸:105.1；谷氨酸：147.1；脯氨酸：115.1；甘氨酸:75.1；丙氨酸:89.1；擷氨酸：117.2；蛋氨酸：149.2；異亮氨酸：131.2；亮氨酸：131.2；酪氨酸:181.2；苯丙氨酸：165.2；組氨酸:155.2；賴氨酸：146.2；精氨酸：174.2。

計算結果表示為：

試樣氨基酸含量在1.00g/100g以下，保留兩位有效數字；
含量在1.00g/100g以上，保留三位數字。

精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的12%。

標準圖譜

出峰順序		保留時間/min	出峰順序		保留時間/min
1	天冬氨酸	5.55	9	蛋氨酸	19.63
2	蘇氨酸	6.60	10	異亮氨酸	21.24
3	絲氨酸	7.09	11	亮氨酸	22.06
4	谷氨酸	8.72	12	酪氨酸	24.52
5	脯氨酸	9.63	13	苯丙氨酸	25.76
6	甘氨酸	12.24	14	組氨酸	30.41
7	丙氨酸	13.10	15	賴氨酸	32.57
8	纈氨酸	16.65	16	精氨酸	40.75