腫瘤-微環(huán)境相互作用在腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療抵抗中發(fā)揮重要作用，并且越來越多的證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞衍生的外泌體可以通過轉(zhuǎn)移分子（例如microRNA、mRNA和蛋白質(zhì)）來系統(tǒng)地調(diào)節(jié)或重編程腫瘤微環(huán)境。PD-L1是一種經(jīng)典的免疫表面蛋白，通過與受體程序性細(xì)胞死亡-1（PD-1）結(jié)合，抑制T細(xì)胞的抗腫瘤功能，有效保護(hù)腫瘤免受免疫監(jiān)視。據(jù)報道，外泌體含有某些類型的蛋白質(zhì)，包括促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移的膜蛋白，例如EGFR和MET。作為膜結(jié)合蛋白，PD-L1是否存在于癌細(xì)胞衍生的外泌體中，是否在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮作用仍然未知。

研究人員通過連續(xù)離心從具有PD-L1表達(dá)或PD-L1敲除（PD-L1 KO）的MDA-MB-231（231）人乳腺癌細(xì)胞和4T1小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離外泌體。透射電鏡顯示這些外泌體通常是球形的，并且是膜包封的，尺寸為30-100 nm。在從表達(dá)PD-L1的人乳腺癌細(xì)胞（231-PD-L1）和小鼠乳腺癌細(xì)胞（4T1-PD-L1）的培養(yǎng)上清中分離的外泌體中檢測到PD-L1；在231-PD-L1 KO或4T1-PD-L1KO細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取的外泌體雖然具有相似水平的外泌體標(biāo)志蛋白CD63和CD81，但檢測不到PD-L1表達(dá)。值得注意的是，外泌體分泌抑制劑GW4869的處理減少了231細(xì)胞中外泌體的產(chǎn)生（如外泌體標(biāo)志蛋白CD63和CD81的減少或外泌體蛋白總量的減少）以及外泌體中PD-L1的水平，但對細(xì)胞裂解物中的PD-L1表達(dá)沒有影響。此外，體外結(jié)合測定顯示PD-1-Fc蛋白同時下拉231-PD-L1衍生的外泌體中的PD-L1（exo-PD-L1）和CD81。231細(xì)胞的免疫熒光（IF）染色和人乳腺癌組織的免疫組織化學(xué)（IHC）雙染色證明PD-L1和CD63在多泡體（MVB）中的共定位，這是釋放前細(xì)胞內(nèi)外泌體的前體形式。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持體外和體內(nèi)的外泌體中存在PD-L1。

為了評估exo-PD-L1的生物學(xué)功能，研究人員首先想知道的是它是否可以將PD-L1轉(zhuǎn)移至具有低（MCF-7）或無PD-L1表達(dá)的其他細(xì)胞（BT549-PD-L1 KO）。他們檢測到PD-L1從exo-PD-L1轉(zhuǎn)移至MCF7或BT549-PD-L1 KO細(xì)胞。 PD-L1蛋白的獲得不是PD-L1基因表達(dá)的結(jié)果，因為這些細(xì)胞中缺乏PD-L1 mRNA。他們還建立了231-PD-L1 EGFP細(xì)胞，并在視覺上證明了231-PD-L1 EGFP衍生的外泌體向BT549細(xì)胞轉(zhuǎn)移PD-L1 EGFP。為了驗證這是否也在體內(nèi)發(fā)生，他們將小鼠4T1-PD-L1 KO細(xì)胞與來自4T1-PD-L1 Flag（EX-PD-L1 Flag）、4T1-PD-L1KO（EX-PD-L1 KO）的外泌體或PBS共注射進(jìn)入BALB/c小鼠的乳腺脂肪墊。5天后收獲腫瘤。腫瘤組織切片的IF染色顯示EX-PD-L1 Flag而不是EX-PD-L1 KO使得4T1-PD-L1 KO細(xì)胞呈PD-L1 Flag陽性。重要的是，流式細(xì)胞術(shù)分析的結(jié)果進(jìn)一步揭示由外泌體轉(zhuǎn)運的PD-L1位于靶細(xì)胞的表面上并且能夠結(jié)合PD-1。這些結(jié)果表明外泌體能夠?qū)⒐δ苄訮D-L1轉(zhuǎn)移至其他細(xì)胞。

鑒于外泌體的PD-L1可以直接結(jié)合PD-1，他們接下來檢查外泌體PD-L1是否影響T細(xì)胞功能。研究結(jié)果顯示，exo-PD-L1顯著抑制T細(xì)胞對BT549-PD-L1 KO細(xì)胞的殺傷作用。接下來，為了探索exo-PD-L1是否抑制CD3/CD28觸發(fā)的T細(xì)胞激活信號通路，他們通過用植物血凝素（PHA）處理外周血單核細(xì)胞（PBMC）來誘導(dǎo)PD-1表達(dá)產(chǎn)生T細(xì)胞母細(xì)胞。結(jié)果表明exo-PD-L1以劑量依賴的方式顯著抑制CD3/CD28誘導(dǎo)的T細(xì)胞的ERK磷酸化和NF-κB活化，以及PHA誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-2（IL-2）分泌，所有這些都是T細(xì)胞活化的指標(biāo)。此外，來自其他癌細(xì)胞系的exo-PD-L1，如結(jié)腸（RKO）和肺（ HCC827）癌細(xì)胞在阻斷T細(xì)胞活化中具有相似的功能。總之，這些數(shù)據(jù)支持外泌體PD-L1抑制T細(xì)胞活化。

接下來，為了評估exo-PD-L1在腫瘤微環(huán)境和體內(nèi)腫瘤進(jìn)展中的作用，他們測量了與EX-PD-L1 Flag、EX-PD-L1 KO或PBS共注射的4T1-PD-L1 KO細(xì)胞的腫瘤生長。與之前的報道一致，4T1-PD-L1 KO細(xì)胞中的PD-L1缺乏導(dǎo)致腫瘤顯著消退；然而，EX-PD-L1 Flag而非EX-PD-L1 KO顯著恢復(fù)了4T1-PD-L1 KO細(xì)胞的腫瘤生長。然后他們將4T1-PD-L1 KO細(xì)胞暴露于增加量的EX-PD-L1 Flag，結(jié)果顯示EX-PD-L1 Flag以劑量依賴性方式促進(jìn)腫瘤生長。此外，與EX-PD-L1 KO或PBS共注射相比，具有EX-PD-L1 Flag共注射的4T1-PD-L1 KO腫瘤表現(xiàn)出更少的顆粒酶B表達(dá)，表明腫瘤區(qū)域中細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性降低。這些結(jié)果表明EX-PD-L1通過抑制T細(xì)胞顆粒酶B的分泌來保護(hù)和促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長。這些發(fā)現(xiàn)與上述體外研究一致，體內(nèi)結(jié)果同樣證明外泌體的PD-L1可與PD-1結(jié)合并抑制T細(xì)胞殺傷活性。

上述IHC染色的結(jié)果顯示PD-L1和外泌體標(biāo)記物CD63在人腫瘤組織樣品中的MVB中的共定位，他們試圖進(jìn)一步確定它們的共定位是否與患者乳腺癌的發(fā)展階段有關(guān)。對一組人乳腺癌組織芯片的分析表明，與疾病的較高階段相關(guān)的PD-L1-CD63共定位水平較高，這與關(guān)于外泌體中PD-L1水平相關(guān)的報道一致。根據(jù)上述結(jié)果，他們假設(shè)生長的腫瘤繼續(xù)將exo-PD-L1分泌到腫瘤微環(huán)境中使T細(xì)胞功能失活，這可能誘導(dǎo)免疫治療抵抗。為了探索靶向外泌體分泌增強(qiáng)免疫療法功效的可能性，他們在小鼠模型中用外泌體分泌抑制劑GW4869與PD-L1抗體組合治療腫瘤。首先，結(jié)果顯示GW4869抑制4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞的外泌體分泌。GW4869對外泌體分泌的抑制抑制BALB/c小鼠中的4T1腫瘤生長，但體外和免疫缺陷裸鼠中4T1細(xì)胞生長不受抑制，表明GW4869治療本身不抑制4T1腫瘤生長，但可能通過調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫，包括抑制exo-PD-L1分泌。因此，如所預(yù)期的，GW4869治療顯著增強(qiáng)了4T1腫瘤生長抑制中的抗PD-L1治療功效。此外，為了特異性抑制4T1細(xì)胞的外泌體分泌，他們構(gòu)建了Tet-on誘導(dǎo)型Rab27a敲低4T1細(xì)胞系。與先前報道一致，通過Dox處理敲低Rab27a顯著抑制外泌體分泌，并且結(jié)果進(jìn)一步顯示Rab27a的敲低顯著抑制4T1腫瘤生長。與GW4869治療相似，腫瘤細(xì)胞中Rab27a敲低對外泌體分泌的特異性抑制顯著增強(qiáng)了抗PD-L1治療功效。因此，腫瘤細(xì)胞中藥理學(xué)抑制劑（GW4869）和遺傳方法（Rab27a敲低）對外泌體分泌的抑制顯著抑制4T1腫瘤生長并增強(qiáng)抗PD-L1治療功效。值得一提的是，通過敲除Rab27a或抑制劑GW4869治療與抗PD-L1抗體治療相比，腫瘤抑制作用相對深遠(yuǎn)，表明腫瘤細(xì)胞中分泌的外泌體PD-L1的阻斷顯著促進(jìn)抗腫瘤免疫。此外，兩者的結(jié)合導(dǎo)致更強(qiáng)的腫瘤抑制。

此外，盡管已經(jīng)證明外泌體將PD-L1從PD-L1陽性轉(zhuǎn)運到PD-L1陰性乳腺癌細(xì)胞，并且exo-PD-L1與T細(xì)胞上的PD-1結(jié)合以抑制T細(xì)胞活化和殺傷活性，據(jù)報道人類骨髓APC也表達(dá)PD-L1并且對免疫療法有重要貢獻(xiàn)。因此，他們還測試了含有PD-L1的外泌體是否可以將PD-L1轉(zhuǎn)運至骨髓APC。他們檢測到PD-L1從exo-PD-L1轉(zhuǎn)移至人單核細(xì)胞系THP1（巨噬細(xì)胞和DC的前體）。流式細(xì)胞術(shù)分析的結(jié)果進(jìn)一步揭示外泌體可以在體外將PD-L1 EGFP轉(zhuǎn)移至人巨噬細(xì)胞和PBMC中的DC。在體內(nèi)，IF染色結(jié)果顯示EX-PD-L1 Flag使腫瘤浸潤的巨噬細(xì)胞PD-L1 Flag呈陽性；然而，他們沒有觀察到DC中的陽性染色。目前尚不清楚為什么體內(nèi)外泌體對PD-L1向DC的轉(zhuǎn)移效率與巨噬細(xì)胞相比較低。這可能是由于較少量的DC和/或一些未知機(jī)制降低了腫瘤微環(huán)境中的效率。然而，結(jié)果表明PD-L1可以通過腫瘤微環(huán)境中含有PD-L1的外泌體轉(zhuǎn)移到多種細(xì)胞類型，包括腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和DC（至少在體外）。因此，外泌體似乎充當(dāng)運輸載體以將PD-L1遞送到腫瘤微環(huán)境中的不同細(xì)胞類型中以調(diào)節(jié)免疫監(jiān)視。盡管尚不清楚表達(dá)PD-L1的巨噬細(xì)胞或DC是否也可能分泌外泌體-PD-L1，但結(jié)果表明，Rab27a敲除腫瘤細(xì)胞中外泌體分泌的阻斷可抑制4T1腫瘤生長，GW4869治療有類似作用。總之，該研究表明，來自腫瘤細(xì)胞的外泌體PD-L1在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的免疫監(jiān)視中起重要作用。

總的來說，目前的研究結(jié)果表明PD-L1通過其在外泌體中的存在發(fā)揮被動保護(hù)作用，同時也在主動防御中起作用，并且含有PD-L1的外泌體減弱腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤免疫。此外，結(jié)果表明，外泌體PD-L1分泌的阻斷有助于抗腫瘤免疫，并且外泌體分泌抑制和抗PD-L1治療的組合具有改善臨床中抗腫瘤反應(yīng)的潛力。