腫瘤-微環境相互作用在腫瘤進展、轉移和治療抵抗中發揮重要作用，并且越來越多的證據表明，腫瘤細胞衍生的外泌體可以通過轉移分子（例如microRNA、mRNA和蛋白質）來系統地調節或重編程腫瘤微環境。PD-L1是一種經典的免疫表面蛋白，通過與受體程序性細胞死亡-1（PD-1）結合，抑制T細胞的抗腫瘤功能，有效保護腫瘤免受免疫監視。據報道，外泌體含有某些類型的蛋白質，包括促進癌癥轉移的膜蛋白，例如EGFR和MET。作為膜結合蛋白，PD-L1是否存在于癌細胞衍生的外泌體中，是否在腫瘤進展中發揮作用仍然未知。

研究人員通過連續離心從具有PD-L1表達或PD-L1敲除（PD-L1 KO）的MDA-MB-231（231）人乳腺癌細胞和4T1小鼠乳腺腫瘤細胞的細胞培養上清液中分離外泌體。透射電鏡顯示這些外泌體通常是球形的，并且是膜包封的，尺寸為30-100 nm。在從表達PD-L1的人乳腺癌細胞（231-PD-L1）和小鼠乳腺癌細胞（4T1-PD-L1）的培養上清中分離的外泌體中檢測到PD-L1；在231-PD-L1 KO或4T1-PD-L1KO細胞培養上清中提取的外泌體雖然具有相似水平的外泌體標志蛋白CD63和CD81，但檢測不到PD-L1表達。值得注意的是，外泌體分泌抑制劑GW4869的處理減少了231細胞中外泌體的產生（如外泌體標志蛋白CD63和CD81的減少或外泌體蛋白總量的減少）以及外泌體中PD-L1的水平，但對細胞裂解物中的PD-L1表達沒有影響。此外，體外結合測定顯示PD-1-Fc蛋白同時下拉231-PD-L1衍生的外泌體中的PD-L1（exo-PD-L1）和CD81。231細胞的免疫熒光（IF）染色和人乳腺癌組織的免疫組織化學（IHC）雙染色證明PD-L1和CD63在多泡體（MVB）中的共定位，這是釋放前細胞內外泌體的前體形式。這些數據進一步支持體外和體內的外泌體中存在PD-L1。

為了評估exo-PD-L1的生物學功能，研究人員首先想知道的是它是否可以將PD-L1轉移至具有低（MCF-7）或無PD-L1表達的其他細胞（BT549-PD-L1 KO）。他們檢測到PD-L1從exo-PD-L1轉移至MCF7或BT549-PD-L1 KO細胞。 PD-L1蛋白的獲得不是PD-L1基因表達的結果，因為這些細胞中缺乏PD-L1 mRNA。他們還建立了231-PD-L1 EGFP細胞，并在視覺上證明了231-PD-L1 EGFP衍生的外泌體向BT549細胞轉移PD-L1 EGFP。為了驗證這是否也在體內發生，他們將小鼠4T1-PD-L1 KO細胞與來自4T1-PD-L1 Flag（EX-PD-L1 Flag）、4T1-PD-L1KO（EX-PD-L1 KO）的外泌體或PBS共注射進入BALB/c小鼠的乳腺脂肪墊。5天后收獲腫瘤。腫瘤組織切片的IF染色顯示EX-PD-L1 Flag而不是EX-PD-L1 KO使得4T1-PD-L1 KO細胞呈PD-L1 Flag陽性。重要的是，流式細胞術分析的結果進一步揭示由外泌體轉運的PD-L1位于靶細胞的表面上并且能夠結合PD-1。這些結果表明外泌體能夠將功能性PD-L1轉移至其他細胞。

鑒于外泌體的PD-L1可以直接結合PD-1，他們接下來檢查外泌體PD-L1是否影響T細胞功能。研究結果顯示，exo-PD-L1顯著抑制T細胞對BT549-PD-L1 KO細胞的殺傷作用。接下來，為了探索exo-PD-L1是否抑制CD3/CD28觸發的T細胞激活信號通路，他們通過用植物血凝素（PHA）處理外周血單核細胞（PBMC）來誘導PD-1表達產生T細胞母細胞。結果表明exo-PD-L1以劑量依賴的方式顯著抑制CD3/CD28誘導的T細胞的ERK磷酸化和NF-κB活化，以及PHA誘導的白細胞介素-2（IL-2）分泌，所有這些都是T細胞活化的指標。此外，來自其他癌細胞系的exo-PD-L1，如結腸（RKO）和肺（ HCC827）癌細胞在阻斷T細胞活化中具有相似的功能。總之，這些數據支持外泌體PD-L1抑制T細胞活化。

接下來，為了評估exo-PD-L1在腫瘤微環境和體內腫瘤進展中的作用，他們測量了與EX-PD-L1 Flag、EX-PD-L1 KO或PBS共注射的4T1-PD-L1 KO細胞的腫瘤生長。與之前的報道一致，4T1-PD-L1 KO細胞中的PD-L1缺乏導致腫瘤顯著消退；然而，EX-PD-L1 Flag而非EX-PD-L1 KO顯著恢復了4T1-PD-L1 KO細胞的腫瘤生長。然后他們將4T1-PD-L1 KO細胞暴露于增加量的EX-PD-L1 Flag，結果顯示EX-PD-L1 Flag以劑量依賴性方式促進腫瘤生長。此外，與EX-PD-L1 KO或PBS共注射相比，具有EX-PD-L1 Flag共注射的4T1-PD-L1 KO腫瘤表現出更少的顆粒酶B表達，表明腫瘤區域中細胞毒性T細胞活性降低。這些結果表明EX-PD-L1通過抑制T細胞顆粒酶B的分泌來保護和促進體內腫瘤生長。這些發現與上述體外研究一致，體內結果同樣證明外泌體的PD-L1可與PD-1結合并抑制T細胞殺傷活性。

上述IHC染色的結果顯示PD-L1和外泌體標記物CD63在人腫瘤組織樣品中的MVB中的共定位，他們試圖進一步確定它們的共定位是否與患者乳腺癌的發展階段有關。對一組人乳腺癌組織芯片的分析表明，與疾病的較高階段相關的PD-L1-CD63共定位水平較高，這與關于外泌體中PD-L1水平相關的報道一致。根據上述結果，他們假設生長的腫瘤繼續將exo-PD-L1分泌到腫瘤微環境中使T細胞功能失活，這可能誘導免疫治療抵抗。為了探索靶向外泌體分泌增強免疫療法功效的可能性，他們在小鼠模型中用外泌體分泌抑制劑GW4869與PD-L1抗體組合治療腫瘤。首先，結果顯示GW4869抑制4T1小鼠乳腺癌細胞的外泌體分泌。GW4869對外泌體分泌的抑制抑制BALB/c小鼠中的4T1腫瘤生長，但體外和免疫缺陷裸鼠中4T1細胞生長不受抑制，表明GW4869治療本身不抑制4T1腫瘤生長，但可能通過調節抗腫瘤免疫，包括抑制exo-PD-L1分泌。因此，如所預期的，GW4869治療顯著增強了4T1腫瘤生長抑制中的抗PD-L1治療功效。此外，為了特異性抑制4T1細胞的外泌體分泌，他們構建了Tet-on誘導型Rab27a敲低4T1細胞系。與先前報道一致，通過Dox處理敲低Rab27a顯著抑制外泌體分泌，并且結果進一步顯示Rab27a的敲低顯著抑制4T1腫瘤生長。與GW4869治療相似，腫瘤細胞中Rab27a敲低對外泌體分泌的特異性抑制顯著增強了抗PD-L1治療功效。因此，腫瘤細胞中藥理學抑制劑（GW4869）和遺傳方法（Rab27a敲低）對外泌體分泌的抑制顯著抑制4T1腫瘤生長并增強抗PD-L1治療功效。值得一提的是，通過敲除Rab27a或抑制劑GW4869治療與抗PD-L1抗體治療相比，腫瘤抑制作用相對深遠，表明腫瘤細胞中分泌的外泌體PD-L1的阻斷顯著促進抗腫瘤免疫。此外，兩者的結合導致更強的腫瘤抑制。

此外，盡管已經證明外泌體將PD-L1從PD-L1陽性轉運到PD-L1陰性乳腺癌細胞，并且exo-PD-L1與T細胞上的PD-1結合以抑制T細胞活化和殺傷活性，據報道人類骨髓APC也表達PD-L1并且對免疫療法有重要貢獻。因此，他們還測試了含有PD-L1的外泌體是否可以將PD-L1轉運至骨髓APC。他們檢測到PD-L1從exo-PD-L1轉移至人單核細胞系THP1（巨噬細胞和DC的前體）。流式細胞術分析的結果進一步揭示外泌體可以在體外將PD-L1 EGFP轉移至人巨噬細胞和PBMC中的DC。在體內，IF染色結果顯示EX-PD-L1 Flag使腫瘤浸潤的巨噬細胞PD-L1 Flag呈陽性；然而，他們沒有觀察到DC中的陽性染色。目前尚不清楚為什么體內外泌體對PD-L1向DC的轉移效率與巨噬細胞相比較低。這可能是由于較少量的DC和/或一些未知機制降低了腫瘤微環境中的效率。然而，結果表明PD-L1可以通過腫瘤微環境中含有PD-L1的外泌體轉移到多種細胞類型，包括腫瘤細胞、巨噬細胞和DC（至少在體外）。因此，外泌體似乎充當運輸載體以將PD-L1遞送到腫瘤微環境中的不同細胞類型中以調節免疫監視。盡管尚不清楚表達PD-L1的巨噬細胞或DC是否也可能分泌外泌體-PD-L1，但結果表明，Rab27a敲除腫瘤細胞中外泌體分泌的阻斷可抑制4T1腫瘤生長，GW4869治療有類似作用。總之，該研究表明，來自腫瘤細胞的外泌體PD-L1在調節腫瘤微環境的免疫監視中起重要作用。

總的來說，目前的研究結果表明PD-L1通過其在外泌體中的存在發揮被動保護作用，同時也在主動防御中起作用，并且含有PD-L1的外泌體減弱腫瘤微環境中的抗腫瘤免疫。此外，結果表明，外泌體PD-L1分泌的阻斷有助于抗腫瘤免疫，并且外泌體分泌抑制和抗PD-L1治療的組合具有改善臨床中抗腫瘤反應的潛力。