活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像主要采用生物發(fā)光與熒光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶基因（Luciferase）標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白等熒光報(bào)告基因和FITC、Cy5、Cy7等熒光素及量子點(diǎn)(quantumdot，QD)進(jìn)行標(biāo)記。

小動(dòng)物活體成像技術(shù)是采用高靈敏度制冷CCD配合特制的成像暗箱和圖像處理軟件，使得可以直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為。實(shí)驗(yàn)者借此可以觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過程。

由于具有更高量子效率CCD的問世，使活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)具有越來越高的靈敏度，對(duì)腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè)靈敏度極高；另外，該技術(shù)不涉及放射性物質(zhì)和方法，非常安全。因其操作極其簡(jiǎn)單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高、實(shí)驗(yàn)成本低等特點(diǎn)，在剛剛發(fā)展起來的幾年時(shí)間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面。

一、小動(dòng)物活體成像概述

1. 熒光發(fā)光成像

熒光成像的標(biāo)記對(duì)象較為廣泛，可以是動(dòng)物、細(xì)胞、微生物、基因，也可以是抗體、藥物、納米材料等。常用的有綠色熒光蛋白( GFP)、紅色熒光蛋白( DsRed)及其它熒光報(bào)告基團(tuán)，標(biāo)記方法與體外熒光成像相似，熒光成像具有費(fèi)用低廉和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。同生物發(fā)光在動(dòng)物體內(nèi)的穿透性相似，紅光的穿透性在體內(nèi)比藍(lán)綠光的穿透性效率高，近紅外熒光為成像觀察的最佳選擇。

雖然熒光信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于生物發(fā)光，但非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生物發(fā)光。雖然許多公司采用不同的技術(shù)分離背景光，但是受到熒光特性的限制，很難完全消除背景噪音。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度較低。

盡管目前大部分高水平的文章還是應(yīng)用生物發(fā)光的方法來研究活體動(dòng)物體內(nèi)成像。但是，熒光成像有其方便，直觀，標(biāo)記靶點(diǎn)多樣和易于被大多數(shù)研究人員接受的優(yōu)點(diǎn)，在一些植物分子生物學(xué)研究和觀察小分子體內(nèi)代謝方面也得到應(yīng)用。對(duì)于不同的研究，可根據(jù)兩者的特點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)要求，選擇合適的方法。例如利用綠色熒光蛋白和熒光素酶對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物進(jìn)行雙重標(biāo)記，用成熟的熒光成像技術(shù)進(jìn)行體外檢測(cè)，進(jìn)行分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究，然后利用生物發(fā)光技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)，進(jìn)行活體動(dòng)物體內(nèi)研究。

熒光發(fā)光是通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光?？紤]到不同熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜EX（excitation spectrum）和激發(fā)光譜EM（emission 8pectrum）的不同，要選擇對(duì)應(yīng)的激發(fā)和發(fā)射濾片。常用熒光蛋白和熒光染料的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)見表1。

表1 常用熒光蛋白和熒光染料的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)

2. 生物發(fā)光成像

活體生物熒光成像技術(shù)是指在小的哺乳動(dòng)物體內(nèi)利用報(bào)告基因-熒光素酶基因表達(dá)所產(chǎn)生的熒光素酶蛋白與其小分子底物熒光素在氧、Mg2+離子存在的條件下消耗ATP發(fā)生氧化反應(yīng)，將部分化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姽饽茚尫?。然后在體外利用敏感的CCD設(shè)備形成圖像。熒光素酶基因可以被插入多種基因的啟動(dòng)子，成為某種基因的報(bào)告基因，通過監(jiān)測(cè)報(bào)告基因從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的監(jiān)測(cè)。

生物熒光實(shí)質(zhì)是一種化學(xué)熒光，螢火蟲熒光素酶在氧化其特有底物熒光素的過程中可以釋放波長(zhǎng)廣泛的可見光光子，其平均波長(zhǎng)為560 nm(460—630 nm)，這其中包括重要的波長(zhǎng)超過600 nm的紅光成分。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)血紅蛋白是吸收可見光的主要成分，能吸收中藍(lán)綠光波段的大部分可見光；水和脂質(zhì)主要吸收紅外線，但其均對(duì)波長(zhǎng)為590—800 nm的紅光至近紅外線吸收能力較差，因此波長(zhǎng)超過600 nm的紅光雖然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳動(dòng)物組織被高靈敏的CCD檢測(cè)到。

生物發(fā)光成像的優(yōu)點(diǎn)可以非侵入性，實(shí)時(shí)連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)體內(nèi)的各種生物學(xué)過程，從而可以減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量，及降低個(gè)體間差異的影響；由于背景噪聲低，所以具有較高的敏感性；不需要外源性激發(fā)光，避免對(duì)體內(nèi)正常細(xì)胞造成損傷，有利于長(zhǎng)期觀察；此外還有無(wú)放射性等其他優(yōu)點(diǎn)。

然而生物發(fā)光也有自身的不足之處：例如波長(zhǎng)依賴性的組織穿透能力，光在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)傳播時(shí)會(huì)被散射和吸收，光子遇到細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)時(shí)會(huì)發(fā)生折射，而且不同類型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性也不盡相同，其中血紅蛋白是吸收光子的主要物質(zhì)；由于是在體外檢測(cè)體內(nèi)發(fā)出的信號(hào)，因而受到體內(nèi)發(fā)光源位置及深度影響；另外還需要外源性提供各種熒光素酶的底物，且底物在體內(nèi)的分布與藥動(dòng)力學(xué)也會(huì)影響信號(hào)的產(chǎn)生；由于熒光素酶催化的生化反應(yīng)需要氧氣、鎂離子及ATP等物質(zhì)的參與，受到體內(nèi)環(huán)境狀態(tài)的影響。

二、小動(dòng)物活體成像

1. 制作動(dòng)物模型

可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要通過尾靜脈注射、皮下移植、原位移植等方法接種已標(biāo)記的細(xì)胞或組織。在建模時(shí)應(yīng)認(rèn)真考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮瓦x擇熒光標(biāo)記，如標(biāo)記熒光波長(zhǎng)短，則穿透效率不高，建模時(shí)不宜接種深部臟器和觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)移，但可以觀察皮下瘤和解剖后臟器直接成像。深部臟器和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的觀察大多選用熒光素酶標(biāo)記。

2. 活體成像

小鼠經(jīng)過常規(guī)麻醉（氣麻、針麻皆可）后放入成像暗箱平臺(tái)，軟件控制平臺(tái)的升降到一個(gè)合適的視野，自動(dòng)開啟照明燈（明場(chǎng)）拍攝第一次背景圖。下一步，自動(dòng)關(guān)閉照明燈，在沒有外界光源的條件下（暗場(chǎng)）拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的特異光子。明場(chǎng)與暗場(chǎng)的背景圖疊加后可以直觀的顯示動(dòng)物體內(nèi)特異光子的部位和強(qiáng)度，完成成像操作。值得注意的是熒光成像應(yīng)選擇合適的激發(fā)和發(fā)射濾片，生物發(fā)光則需要成像前體內(nèi)注射底物激發(fā)發(fā)光。

3. 數(shù)據(jù)處理

小動(dòng)物活體成像圖像處理軟件除了提供含有光子強(qiáng)度標(biāo)尺的成像圖片外，還能計(jì)算分析發(fā)光面積、總光子數(shù)、光子強(qiáng)度的相關(guān)參數(shù)供實(shí)驗(yàn)者參考。

4. 實(shí)驗(yàn)影響因素

原則上，如預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)拍攝出圖片非特異性雜點(diǎn)多，需降低曝光時(shí)間；反之，如信號(hào)過弱可適當(dāng)延長(zhǎng)曝光時(shí)間。但曝光時(shí)間的延長(zhǎng)，不僅增加了目的信號(hào)，對(duì)于背景噪音也存在一個(gè)放大效應(yīng)。同一批實(shí)驗(yàn)應(yīng)保持一致的曝光時(shí)間，同時(shí)還應(yīng)保持標(biāo)本相對(duì)位置和形態(tài)的一致，從而減少實(shí)驗(yàn)誤差。

進(jìn)行熒光成像時(shí)，實(shí)驗(yàn)者可選擇背景熒光低不容易反光的黑紙放在動(dòng)物標(biāo)本身下，減少金屬載物臺(tái)的反射干擾。動(dòng)物體內(nèi)很多物質(zhì)在受到激發(fā)光激發(fā)后，會(huì)發(fā)出熒光，產(chǎn)生的非特異性熒光會(huì)影響到檢測(cè)靈敏度。背景熒光主要是來源于皮毛和血液的自發(fā)熒光，皮毛中的黑色素是皮毛中主要的自發(fā)熒光源，其發(fā)光光線波長(zhǎng)峰值在500一520 nm左右，在利用綠色熒光作為成像對(duì)象時(shí)，影響最為嚴(yán)重，產(chǎn)生的非特異性熒光會(huì)影響到檢測(cè)靈敏度和特異性。動(dòng)物尿液或其他雜質(zhì)如沒有及時(shí)清除，成像中也會(huì)出現(xiàn)非特異性信號(hào)。

由于各廠商的圖像分析軟件不同，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析方法也有區(qū)別?；铙w成像系統(tǒng)使用時(shí)，實(shí)驗(yàn)者考慮到非特異性雜信號(hào)，以及成像圖片美觀等方面，可能會(huì)調(diào)節(jié)信號(hào)的閾值，因此在分析信號(hào)光子數(shù)或信號(hào)面積時(shí)，應(yīng)考慮閾值的改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。正確選擇ROI區(qū)域，可提高分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

三、展望

小動(dòng)物活體成像技術(shù)具有靈敏度高、直觀、操作簡(jiǎn)單、能同時(shí)觀測(cè)多個(gè)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，相比PET、SPECT無(wú)放射損害等優(yōu)點(diǎn)，但也有其自身的缺陷，例如動(dòng)物組織對(duì)光子吸收、空間分辨率較低等問題，因而仍需不斷地完善和改進(jìn)。小動(dòng)物活體成像按成像性質(zhì)屬于功能成像，如何能更好地與結(jié)構(gòu)成像技術(shù)（microCT、超聲等）相結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果不但能夠定量，而且還能精確定位，這是活體成像技術(shù)今后的發(fā)展方向之一。

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