EGFR基因突變，基因編輯技術(shù)揭示癌癥耐藥性途徑

來(lái)源：作者：人氣：-發(fā)表時(shí)間：2024-11-18 14:24:00【大中小】

摘要：研究人員使用堿基和引物編輯來(lái)發(fā)現(xiàn)影響癌癥進(jìn)展和耐藥性的新的EGFR基因突變。

通過(guò)結(jié)合先進(jìn)的基因編輯技術(shù)，科學(xué)家們確定了影響肺癌腫瘤生長(zhǎng)和耐藥性的關(guān)鍵突變，為量身定制的癌癥治療提供了新的途徑。

在最近發(fā)表在《自然生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）雜志上的一項(xiàng)研究中，瑞士的研究人員使用堿基和引物編輯技術(shù)，在多種細(xì)胞系（包括癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞）中創(chuàng)建和分析了上皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因的各種變體，以研究它們對(duì)癌癥進(jìn)展和耐藥性的影響。他們發(fā)現(xiàn)，以前已知的和新的突變都與EGFR激活和藥物反應(yīng)顯著相關(guān)，證明了該方法的準(zhǔn)確性，并揭示了影響腫瘤生長(zhǎng)和耐藥性機(jī)制的新途徑。

圖1 利用堿基和素?cái)?shù)編輯對(duì)遺傳變異進(jìn)行多模態(tài)掃描

盡管基因組測(cè)序取得了進(jìn)展，但一些遺傳變異仍被歸類為不確定意義變異（VUS），使疾病的診斷和治療復(fù)雜化。這在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）相關(guān)的EGFR變異中尤其明顯，其中約50%的EGFR變異是VUS。目前的治療方法，包括靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制劑（TKIs），對(duì)非典型突變的效果較差，導(dǎo)致預(yù)后不佳和耐藥。新的方法，如多重檢測(cè)和基于聚類、定期間隔的短回文重復(fù)（CRISPR）的篩選，有助于評(píng)估變異，但它們目前缺乏分析所有可能突變所需的規(guī)模、特異性和準(zhǔn)確性。

堿基編輯技術(shù)提高了準(zhǔn)確性，但受到意外編輯和限制性突變類型的限制。Prime編輯是一種更先進(jìn)的方法，可以精確地引入多種突變，包括插入和缺失，為評(píng)估VUS的致病性提供了一種高通量方法，并為個(gè)性化癌癥治療開(kāi)辟了新的途徑。在本研究中，研究人員使用堿基和引物編輯的組合對(duì)EGFR基因的整個(gè)編碼序列進(jìn)行高分辨率突變掃描，以鑒定與各種細(xì)胞類型的癌癥進(jìn)展和耐藥性相關(guān)的已知和新的突變。

研究人員使用依賴野生型EGFR生長(zhǎng)的MCF10A細(xì)胞來(lái)評(píng)估EGFR變異的致病性。他們?cè)贓GFR中引入了特異性突變，通過(guò)慢病毒傳遞，使用胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯器（BE3.9max和ABE8e）促進(jìn)激活，使用1,496個(gè)單導(dǎo)核糖核酸（sgRNAs）庫(kù)靶向所有EGFR外顯子和關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)。在編輯和剝奪EGF之后，研究人員對(duì)sgRNAs進(jìn)行測(cè)序，以鑒定影響細(xì)胞活力的突變。在后續(xù)篩選中，他們通過(guò)用吉非替尼或奧西替尼治療MCF10A細(xì)胞，并分析sgRNA文庫(kù)以識(shí)別新的耐藥變體，評(píng)估了與耐藥相關(guān)的EGFR突變。

為了擴(kuò)大他們的突變篩選，研究人員還使用了啟動(dòng)編輯來(lái)引入更廣泛的EGFR突變，包括來(lái)自ClinVar和COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)的突變。他們?cè)O(shè)計(jì)了沒(méi)有MLH1基因的MCF10A細(xì)胞，以提高引物編輯效率，并通過(guò)慢病毒載體傳遞了針對(duì)14個(gè)已知和重要的EGFR突變的引物編輯指導(dǎo)RNA （pegRNAs）。在pegrna中包含同義突變使研究人員能夠檢查它們對(duì)編輯效率的影響。

圖2 堿基編輯掃描屏幕識(shí)別MCF10A細(xì)胞中的EGFR激活突變

在MCF10A細(xì)胞中，這兩種堿基編輯器的編輯效率都達(dá)到了95-97%，隨著時(shí)間的推移，突變會(huì)積累，一些等位基因會(huì)出現(xiàn)多次編輯。篩選發(fā)現(xiàn)了基本sgRNAs的缺失，證實(shí)了篩選檢測(cè)損害細(xì)胞活力的突變的能力。值得注意的是，EGFR中影響剪接位點(diǎn)的突變、無(wú)義突變和錯(cuò)義突變與功能喪失效應(yīng)相關(guān)。

篩選顯示已知的和幾種新的EGFR突變與耐藥性有關(guān)，特別是在EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的atp結(jié)合口袋中。對(duì)于吉非替尼，已知的突變?nèi)鏣hr790Met，以及先前未表征的結(jié)合袋附近突變，包括Val726、Met766和Thr854，被證實(shí)具有耐藥性。對(duì)于奧西替尼，Thr790Ala、Gln791Arg和Val845Ala等突變以及c端結(jié)構(gòu)域突變富集，提示不同的耐藥機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了EGFR中特定的分子內(nèi)相互作用和結(jié)構(gòu)變化有助于抵抗各種TKIs。

堿基編輯還揭示了影響藥物敏感性的突變的微妙觀點(diǎn)。例如，Val845Ala突變對(duì)奧西替尼耐藥，但對(duì)吉非替尼敏感，而其他突變，如Lys852Glu，對(duì)兩種藥物都有耐藥性。繼發(fā)性突變，如Thr790Met，進(jìn)一步增強(qiáng)了egfr突變PC-9細(xì)胞的耐藥性。引體編輯引入了ClinVar和COSMIC中列出的近92%的EGFR變異，確定了新的突變，包括外顯子20插入和與耐藥性相關(guān)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域突變。

該研究證明了多模態(tài)精確堿基和引物編輯的優(yōu)勢(shì)，并為EGFR激活和耐藥性提供了見(jiàn)解。然而，它依賴于egf獨(dú)立增殖作為EGFR信號(hào)的代理，并且沒(méi)有分析受體相互作用或雜合效應(yīng)，因此受到限制。未來(lái)的研究可以利用額外的細(xì)胞模型和工程細(xì)胞系來(lái)解決這些問(wèn)題。

本研究開(kāi)發(fā)了一個(gè)強(qiáng)大的，高分辨率的突變掃描框架，結(jié)合了堿基和起始編輯的能力來(lái)分析與耐藥性和腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)的遺傳變異。將這種方法擴(kuò)展到更廣泛的遺傳元素和細(xì)胞模型，包括原代人類細(xì)胞，將有助于闡明各種遺傳變異的臨床相關(guān)性，并支持個(gè)性化的癌癥治療。

參考資料

[1] Multimodal scanning of genetic variants with base and prime editing