EGFR基因突變，基因編輯技術揭示癌癥耐藥性途徑

來源：作者：人氣：-發表時間：2024-11-18 14:24:00【大中小】

摘要：研究人員使用堿基和引物編輯來發現影響癌癥進展和耐藥性的新的EGFR基因突變。

通過結合先進的基因編輯技術，科學家們確定了影響肺癌腫瘤生長和耐藥性的關鍵突變，為量身定制的癌癥治療提供了新的途徑。

在最近發表在《自然生物技術》（Nature Biotechnology）雜志上的一項研究中，瑞士的研究人員使用堿基和引物編輯技術，在多種細胞系（包括癌細胞和非癌細胞）中創建和分析了上皮生長因子受體（EGFR）基因的各種變體，以研究它們對癌癥進展和耐藥性的影響。他們發現，以前已知的和新的突變都與EGFR激活和藥物反應顯著相關，證明了該方法的準確性，并揭示了影響腫瘤生長和耐藥性機制的新途徑。

圖1 利用堿基和素數編輯對遺傳變異進行多模態掃描

盡管基因組測序取得了進展，但一些遺傳變異仍被歸類為不確定意義變異（VUS），使疾病的診斷和治療復雜化。這在非小細胞肺癌（NSCLC）相關的EGFR變異中尤其明顯，其中約50%的EGFR變異是VUS。目前的治療方法，包括靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制劑（TKIs），對非典型突變的效果較差，導致預后不佳和耐藥。新的方法，如多重檢測和基于聚類、定期間隔的短回文重復（CRISPR）的篩選，有助于評估變異，但它們目前缺乏分析所有可能突變所需的規模、特異性和準確性。

堿基編輯技術提高了準確性，但受到意外編輯和限制性突變類型的限制。Prime編輯是一種更先進的方法，可以精確地引入多種突變，包括插入和缺失，為評估VUS的致病性提供了一種高通量方法，并為個性化癌癥治療開辟了新的途徑。在本研究中，研究人員使用堿基和引物編輯的組合對EGFR基因的整個編碼序列進行高分辨率突變掃描，以鑒定與各種細胞類型的癌癥進展和耐藥性相關的已知和新的突變。

研究人員使用依賴野生型EGFR生長的MCF10A細胞來評估EGFR變異的致病性。他們在EGFR中引入了特異性突變，通過慢病毒傳遞，使用胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯器（BE3.9max和ABE8e）促進激活，使用1,496個單導核糖核酸（sgRNAs）庫靶向所有EGFR外顯子和關鍵調控位點。在編輯和剝奪EGF之后，研究人員對sgRNAs進行測序，以鑒定影響細胞活力的突變。在后續篩選中，他們通過用吉非替尼或奧西替尼治療MCF10A細胞，并分析sgRNA文庫以識別新的耐藥變體，評估了與耐藥相關的EGFR突變。

為了擴大他們的突變篩選，研究人員還使用了啟動編輯來引入更廣泛的EGFR突變，包括來自ClinVar和COSMIC數據庫的突變。他們設計了沒有MLH1基因的MCF10A細胞，以提高引物編輯效率，并通過慢病毒載體傳遞了針對14個已知和重要的EGFR突變的引物編輯指導RNA （pegRNAs）。在pegrna中包含同義突變使研究人員能夠檢查它們對編輯效率的影響。

圖2 堿基編輯掃描屏幕識別MCF10A細胞中的EGFR激活突變

在MCF10A細胞中，這兩種堿基編輯器的編輯效率都達到了95-97%，隨著時間的推移，突變會積累，一些等位基因會出現多次編輯。篩選發現了基本sgRNAs的缺失，證實了篩選檢測損害細胞活力的突變的能力。值得注意的是，EGFR中影響剪接位點的突變、無義突變和錯義突變與功能喪失效應相關。

篩選顯示已知的和幾種新的EGFR突變與耐藥性有關，特別是在EGFR酪氨酸激酶結構域的atp結合口袋中。對于吉非替尼，已知的突變如Thr790Met，以及先前未表征的結合袋附近突變，包括Val726、Met766和Thr854，被證實具有耐藥性。對于奧西替尼，Thr790Ala、Gln791Arg和Val845Ala等突變以及c端結構域突變富集，提示不同的耐藥機制。這些發現強調了EGFR中特定的分子內相互作用和結構變化有助于抵抗各種TKIs。

堿基編輯還揭示了影響藥物敏感性的突變的微妙觀點。例如，Val845Ala突變對奧西替尼耐藥，但對吉非替尼敏感，而其他突變，如Lys852Glu，對兩種藥物都有耐藥性。繼發性突變，如Thr790Met，進一步增強了egfr突變PC-9細胞的耐藥性。引體編輯引入了ClinVar和COSMIC中列出的近92%的EGFR變異，確定了新的突變，包括外顯子20插入和與耐藥性相關的細胞外結構域突變。

該研究證明了多模態精確堿基和引物編輯的優勢，并為EGFR激活和耐藥性提供了見解。然而，它依賴于egf獨立增殖作為EGFR信號的代理，并且沒有分析受體相互作用或雜合效應，因此受到限制。未來的研究可以利用額外的細胞模型和工程細胞系來解決這些問題。

本研究開發了一個強大的，高分辨率的突變掃描框架，結合了堿基和起始編輯的能力來分析與耐藥性和腫瘤生長有關的遺傳變異。將這種方法擴展到更廣泛的遺傳元素和細胞模型，包括原代人類細胞，將有助于闡明各種遺傳變異的臨床相關性，并支持個性化的癌癥治療。

參考資料

[1] Multimodal scanning of genetic variants with base and prime editing