谷胱甘肽親和介質——層析介質優選西寶生物

來源：作者：人氣：-發表時間：2015-10-16 09:47:00【大中小】

GST親和介質是專門設計用于分離純化谷胱甘肽S-轉移酶（GST）標簽蛋白、其它來源的谷胱甘肽S-轉移酶以及和谷胱甘肽具有親和作用的蛋白的親和層析介質。GST親和層析具有操作條件溫和、特異性強的特點，有利于蛋白的活性保持和高純度目標蛋白的快速制備，通常一步親和層析即可得到高純度的目標蛋白。

西寶生物谷胱甘肽親和介質以高交聯的瓊脂糖凝膠為基質，以谷胱甘肽為配基，通過間隔臂長短和配基密度的合理調控，產品具有載量高（~10 mg GST融合蛋白/ml介質）、特異性強、物理和化學穩定性良好、使用壽命長、易放大的特點，是研發和生產的理想選擇。

一、產品特性

參數	指標
基質	4%交聯瓊脂糖凝膠
配基	谷胱甘肽
形狀	球形
介質平均粒徑	90 μm (45-165)
配基密度	~8 mg GSH/mL wet gel
動態載量	~10 mg GST融合蛋白/mL wet gel (Mr 42 kDa) ~3.5 mg GST(大鼠肝臟)/mL wet gel
流速高達（25℃）	450 cm/h
推薦流速	<150 cm/h
耐壓高達	0.3 MPa (3 bar)
pH穩定性	3~12
化學穩定性	在常用的水溶性緩沖液中均穩定，在70%乙醇、30%異丙醇、6M鹽酸胍、1M乙酸（pH 4）中均穩定
物理穩定性	溶液的pH或離子強度影響介質的體積變化率<2%
保存	4-8 ℃（20%乙醇）

二、應用范圍

西寶生物谷胱甘肽親和層析介質廣泛用于GST融合蛋白、其它來源的谷胱甘肽S-轉移酶以及和谷胱甘肽具有親和作用的蛋白的分離純化。實際操作中可采用靜態吸附、重力柱、離心柱、層析柱等模式進行蛋白質的分離純化，其中柱層析操作自動化程度高、分離純化效果好、重現性好，應用較為廣泛。

三、操作步驟

柱層析操作通常包括裝柱、平衡、進料、淋洗、洗脫、再生等步驟（以5.0 × 1.6 cm I.D.，柱高5 cm，柱體積10 ml為例（層析柱（空柱）尺寸：20.0 × 1.6 cm I.D.）。平衡：用5-10CV的平衡緩沖液（20-50 mM PB或Tris/HCl，pH 7.4-8.0，可加入0.15 M NaCl抑制非特異吸附）平衡層析柱，至流出液電導和pH不變（與平衡液一致）。

裝柱：取適量介質放置于燒杯中，勻漿濃度約為50-60%，攪拌均勻后備用（介質和緩沖液均處于純化時所需的溫度）；清洗層析柱，排出柱底部轉接頭篩網/墊片上的氣泡，擰緊底部的轉接頭，加入適量純水至約1 cm高度；介質攪拌均勻后用玻璃棒緊靠柱子內壁引流，將介質勻速、連續地加入到層析柱中（這可以減少氣泡的產生）；介質沉降5-30 min（上層溶液澄清）后小心裝上柱子頂部的轉換接頭（避免殘留氣泡和破壞膠面），然后依次以1、2 mL/min的流速用純水（或平衡緩沖液）壓柱子各2min，最后用5 mL/min的流速壓柱子3-5 min至膠面穩定不變（可在界面處做記號便于后期觀察膠面變化情況），將頂部的轉換接頭擰松，緩慢向下移動至膠面后擰緊轉換接頭。
平衡：用5CV（柱體積）的平衡緩沖液（50 mM Tris-HCl + 0.15 M NaCl，pH 8.0，）平衡層析柱（添加適當濃度（0.1-0.2 M）的NaCl可抑制蛋白的非特異性吸附，添加適當濃度（1-10 mM）的DTT可提高部分蛋白的穩定性和結合載量），流速為2 ml/min（后續操作流速均為2 mL/min，操作流速不高于裝柱流速的75%），至流出液電導和pH不變（與平衡液一致）。原位清洗：為了避免不同樣品間的相互干擾，或者當介質污染比較嚴重時（反壓增加），需要對介質進行在位清洗。
進料：樣品緩沖液應盡可能與平衡液一致。菌體破碎時直接采用平衡緩沖液溶解（1 g菌體對應5-10 mL緩沖液）；固體樣品可用平衡液溶解配制；低濃度樣品溶液可用平衡液透析；高濃度樣品溶液可用平衡液稀釋。為了避免堵塞層析柱，樣品應經離心或微濾（0.45μm）處理。進料量根據介質的載量和料液中目標蛋白的含量計算（介質的動態載量與流速密切相關，較低流速有利于提高載量）。
淋洗：上樣完畢后繼續用平衡緩沖液淋洗至基線。
洗脫：用洗脫緩沖液（50 mM Tris-HCl+10 mM GSH，pH 8.0，GSH濃度需要根據目標蛋白的結合力進行適當調整，GSH易被氧化，現用現配，）洗脫，收集流出液。
原位清洗：介質使用數次（具體次數與原料的種類和來源及實驗要求有關）后，介質上會有部分沉淀物、變性蛋白及非特異性吸附的蛋白，導致介質結合能力的下降，需要對介質進行在位清洗（100 cm/h）。

（1）去除沉淀物及變性蛋白，可用2 CV 6 M鹽酸胍清洗，然后立即用5 CV中性PBS緩沖液平衡至中性。

（2）去除疏水性結合的蛋白、脂蛋白和脂類物質，可用3-4 CV的70%乙醇或30%異丙醇清洗（20 min以上），并用3-5 CV的純水沖洗。

（3）也可用2 CV 0.01-0.1 M的NaOH清洗，然后立即用5 CV中性PBS緩沖液平衡至中性（優先采用方法（1）和（2）清洗）。

其它注意事項：在裝柱、使用和保存柱子的時候，要避免柱子流干，氣泡進入。

四、具體應用實例

實例一：蛋白樣品：GST融合蛋白（菌體破碎：按照1 g菌體對應10 ml Buffer A配置菌體溶液，冰水浴中超聲破碎30min，超聲3S/停3S）、離心（1000 g,4度,15 min），分子量約為42kDa）；

層析介質：GST QZT 4FF介質（2.55 cm × 1.0 cm I.D., CV=2.0 mL）；

對照介質（2.55 cm × 1.0 cm I.D., CV=2.0 mL, 國際領先品牌）；

Buffer A: 50 mM Tris-HCl+0.15M NaCl, pH 8.0；

Buffer B: 50 mM Tris-HCl+10 mM GSH (GSH易氧化，現配現用)；

上樣量：10 mL；

流速：0.5 mL/min。